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.2011年12月6日；50(48):10473-83.
doi:10.1021/bi201120q。 Epub 2011年11月11日。

酿酒酵母的组蛋白H4赖氨酸20是单甲基化的，在亚大细胞沉默中起作用

克里斯托弗·爱德华兹 1, 党卫伟, Shelley L Berger女士
附属公司

酿酒酵母的组蛋白H4赖氨酸20是单甲基化的，在亚大细胞沉默中起作用

克里斯托弗·爱德华兹等。 生物化学. .

摘要

组蛋白经历与重要生物过程相关的翻译后修饰。先前的研究表明，在芽殖酵母酿酒酵母中，包括在H4赖氨酸20（K20）中，不存在与封闭或抑制染色质相关的赖氨酸甲基化。在这里，我们提供了芽殖酵母中H4 K20单甲基化（K20me1）的功能证据。通过使用甲基特异性抗体进行西方分析，可以在内源性H4上检测到H4 K20me1，并且该信号通过H4 K20取代和与H4 K20me1肽竞争而被消除。使用染色质免疫沉淀法，我们发现H4 K20me1水平在异色位置最高，包括亚群、无声交配型位点和rDNA重复，在常染色质内的着丝粒最低。此外，H4 K20A取代强烈降低了端粒和沉默交配型位点的异色报告基因沉默，并导致亚端粒内源性基因表达增加。H4 K20me1的位置与H4 K20A取代作用之间的相关性表明，这种修饰起到了抑制作用。我们的发现揭示了出芽酵母中第一个负调控组蛋白甲基化，并表明H4 K20me1从简单到复杂的真核生物进化上是保守的。

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数字

图1
图1
芽殖酵母中检测到H4 K20me1。（A） 将与H4的前30个氨基酸匹配的肽与乙酰化赖氨酸16或单甲基赖氨酸20一起发现在PVDF上，并用抗体进行探测。肽、肽量和抗体分别显示在印迹的左侧、顶部和底部。（B） H4 K20me1在不同遗传背景、交配类型和倍性的菌株的全细胞提取物（WCE）中可检测到，无论H4基因是否存在于基因组或质粒中，都可检测到H4 K20R，并通过H4 K2R替换而消除。在聚丙烯酰胺凝胶上分析WCE，转移到PVDF，并用抗体进行探测。H4液位为负载控制。小牛胸腺H4为阳性抗体对照。抗体显示在每个印迹的左侧。菌株、遗传背景和交配类型显示在每条车道的上方。菌株FY1716、YKI071和YWD193具有仅存在于质粒上的H3/H4基因。（C） 为了确认H4 K20me1信号是H4而不是类似的迁移蛋白，对未标记H4、FLAG-H4或FLAG-H4K20R的WCE进行FLAG亲和纯化。WCEs和洗脱物通过西方分析进行分析。抗体显示在每个印迹的左侧。FLAG标签和K20R替换显示在每条车道的上方。星号表示WCE中模糊FLAG-H4的非特定带。箭头表示WCE中未标记的H4和洗脱液中的FLAG-H4。（D&E）H4 K20me1西部信号优先与单甲基化而非非甲基化H4肽竞争。在聚丙烯酰胺凝胶上分析WCE，将其转移到PVDF中，并用抗H4 K20me1抗体（1mg/mL）进行探测，这些抗体是预先孵育的，不含在赖氨酸20下发生或未发生单甲基化的肽或H4肽（D中为100ng/mL或1ng/mL，E中为100ng/mL）。H4液位为负载控制。抗体显示在每个印迹的左侧。菌株、肽和肽浓度显示在每个印迹的上方。箭头表示H4 K20me1。星号表示非特定带。
图2
图2
H4 K20me1，用Millipore抗体04–735检测。（A，B）肽斑点印迹，如图1A所示。（C） 可修饰组蛋白残基的替换不影响H4 K20me1水平，H4 K20替换不影响H4 K16ac水平。通过western分析，分析了组蛋白野生型或突变型酵母的WCEs。抗体和组蛋白突变分别显示在每个印迹的左侧和上方。星号表示H4 K16ac探针上存在非特异性带。（D） 蛋白质印迹与肽竞争，如1D，E。
图3
图3
删除和过度表达候选基因不会改变H4 K20me1水平。（A，B）FLAG-H4通过FLAG-亲和纯化从候选HMT缺失的菌株中纯化。western分析分析WCEs和FLAG洗脱液。抗体和菌株分别显示在每个印迹的左侧和上方。FLAG级别是一个加载控制。（C） 通过western分析分析了来自质粒中过度表达候选HMT的菌株的WCE。抗体和菌株分别显示在每个印迹的左侧和上方。H4液位为负载控制。H4 K20R菌株用作阴性抗体对照。
图4
图4
H4 K20me1的ChIP-qPCR分析。用抗H4 K20me1或总H4抗体免疫沉淀WT或K20R组蛋白H4酵母的超声染色质，并用qPCR分析共纯化DNA。横线表示H4 K20me1水平归一化为H4总水平（A）或无抗体或H4 K200me1水平标准化为输入水平（B）。基因组位置显示在每对条的下方。（C） 几个位点H3 K4me3与H4 K20me1水平相对于H4水平的比较。（D） 几个地区的H4 K20me1水平相对于H4水平：行动1ORF、，RCK2-是3区域，以及YLR454瓦区域。图表下方的横条和箭头分别代表基因组和基因。基因上方条形图条的位置指示检查区域的位置。A、 B和D代表三个实验的平均值（S.E.M.）的平均值和标准误差。
图4
图4
H4 K20me1的ChIP-qPCR分析。用抗H4 K20me1或总H4抗体免疫沉淀WT或K20R组蛋白H4酵母的超声染色质，并用qPCR分析共纯化DNA。横线表示H4 K20me1水平归一化为H4总水平（A）或无抗体或H4 K200me1水平标准化为输入水平（B）。基因组位置显示在每对条的下方。（C） 几个位点H3 K4me3与H4 K20me1水平相对于H4水平的比较。（D） 几个地区的H4 K20me1水平相对于H4水平：行动1ORF、，RCK2-是3区域，以及544瓦区域。图表下方的横条和箭头分别代表基因组和基因。基因上方条形图条的位置指示检查区域的位置。A、 B和D代表三个实验的平均值（S.E.M.）的平均值和标准误差。
图5
图5
H4 K20me1的表型分析。（A） 稀释hmlбURA3 ADE2-具有野生型或突变组蛋白的TEL-VR酵母在合成完全（SC）、SC-URA或SC+5FOA培养基上生长。培养基和菌株分别显示在每个平板的上方和右侧。与SC培养基相比，SC-URA培养基上的生长增加，SC+5FOA培养基上生长减少，表明生长增加URA3公司表达式。白色和红色酵母着色分别表示ADE2型表达和沉默。（B） 通过H4 K20me1和总H4的ChIP以及收获RNA的qPCR测定端粒7L近端和远端的H4 K20me1水平和基因表达。（顶部）ChIP如图4所示。H4 K20me1水平/总H4水平显示为平均值和标准误差。位于染色体7L上的ChIP位置在地图中由黑色三角形表示，而上述数字表示哪些位置对应于上图中的哪些条。使用Wilcoxon秩和检验将位置2-5与位置6-8进行比较，并生成指示的P值。（底部）用WT、K20R或K20A组蛋白H4从酵母中提取RNA。通过qPCR测定端粒7L近端和远端基因的mRNA水平，并将其归一化为行动1mRNA。显示了平均值和平均值的标准误差。使用T检验比较WT和H4 K20A样品，并生成指示的P值。（C） H4 K20me1水平在复制年龄较大的酵母中低于年轻酵母。用西方分析法分析了来自复制性年轻或老酵母的WCEs。抗体显示在每个印迹的左侧。样本和应变显示在每条车道的上方。括号中显示了每个酵母样品的芽痕（细胞分裂）平均数。H3水平是一种负载控制。
图5
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H4 K20me1的表型分析。（A） 稀释hmlбURA3 ADE2-含有野生型或突变组蛋白的TEL-VR酵母生长在合成完整（SC）、SC-URA或SC+5FOA培养基上。培养基和菌株分别显示在每个平板的上方和右侧。与SC培养基相比，SC-URA培养基上的生长增加，SC+5FOA培养基上生长减少，表明生长增加URA3公司表达式。白色和红色酵母着色分别表示ADE2型表达和沉默。（B） 通过H4 K20me1和总H4的ChIP以及通过收获的RNA的qPCR来确定端粒7L近端和远端的H4 K20me1水平以及基因的表达。（顶部）ChIP如图4所示。H4 K20me1水平/总H4水平显示为平均值和标准误差。位于7L号染色体上的ChIP位置在地图中用黑色三角形表示，而上述数字表示的是与上图中的条对应的位置。使用Wilcoxon秩和检验将位置2-5与位置6-8进行比较，并生成指示的P值。（底部）用WT、K20R或K20A组蛋白H4从酵母中提取RNA。通过qPCR测定端粒7L近端和远端基因的mRNA水平，并将其归一化为行动1mRNA。显示了平均值和平均值的标准误差。使用T检验比较WT和H4 K20A样品，并生成指示的P值。（C） H4 K20me1水平在复制年龄较大的酵母中低于年轻酵母。用西方分析法分析了来自复制性年轻或老酵母的WCEs。抗体显示在每个印迹的左侧。样本和应变显示在每条车道的上方。括号中显示了每个酵母样品的芽痕（细胞分裂）平均数。H3水平是一种负载控制。
图5
图5
H4 K20me1的表型分析。（A） 稀释hmlбURA3 ADE2-含有野生型或突变组蛋白的TEL-VR酵母生长在合成完整（SC）、SC-URA或SC+5FOA培养基上。培养基和菌株分别显示在每个平板的上方和右侧。与SC培养基相比，SC-URA培养基上的生长增加，SC+5FOA培养基上生长减少，表明生长增加URA3公司表达式。白色和红色酵母着色分别表示ADE2型表达和沉默。（B） 通过H4 K20me1和总H4的ChIP以及收获RNA的qPCR测定端粒7L近端和远端的H4 K20me1水平和基因表达。（顶部）ChIP如图4所示。H4 K20me1水平/总H4水平显示为平均值和标准误差。位于7L号染色体上的ChIP位置在地图中用黑色三角形表示，而上述数字表示的是与上图中的条对应的位置。使用Wilcoxon秩和检验将位置2-5与位置6-8进行比较，并生成指示的P值。（底部）用WT、K20R或K20A组蛋白H4从酵母中提取RNA。通过qPCR测定端粒7L近端和远端基因的mRNA水平，并将其归一化为动作1mRNA。显示了平均值和平均值的标准误差。使用T检验比较WT和H4 K20A样品，并生成指示的P值。（C） 复制性老酵母的H4 K20me1水平低于年轻酵母。用西方分析法分析了来自复制性年轻或老酵母的WCEs。抗体显示在每个印迹的左侧。样本和应变显示在每条车道的上方。括号中显示了每个酵母样品的芽痕（细胞分裂）平均数。H3水平是一种负载控制。
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