A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology

doi:10.1371/journal.pone.0025661

.2011;6（9）：e25661。

doi:10.1371/journal.pone.0025661。 Epub 2011年9月30日。

用于乳腺组织形态发生和干细胞生物学研究的多功能三维共培养系统

乔纳森·坎贝尔¹, 娜塔莉亚·达维登科, 玛丽亚·卡法雷尔, 露丝·E·卡梅隆, 克里斯汀·沃森

附属公司

PMID： 21984937
预防性维修识别码： PMC3184152型
内政部： 10.1371/journal.pone.0025661

用于乳腺组织形态发生和干细胞生物学研究的多功能三维共培养系统

乔纳森·坎贝尔等。公共科学图书馆一号. 2011.

.2011;6（9）：e25661。

doi:10.1371/journal.pone.0025661。 Epub 2011年9月30日。

作者

乔纳森·坎贝尔¹, 娜塔莉亚·达维登科, 玛利亚·卡法雷尔, 露丝·E·卡梅隆, 克里斯汀·沃森

附属

¹英国剑桥大学网球场路剑桥大学病理学系。jjc55@cam.ac.uk

PMID： 21984937
预防性维修识别码： PMC3184152型
内政部： 10.1371/日记.pone.0025661

摘要

对干细胞生态位和癌症治疗效果的研究需要复杂的多细胞结构以及不同类型细胞与细胞外基质（ECM）在三维空间中的相互作用。我们设计了一个乳腺三维体外模型，该模型包含一个明确的多孔胶原/透明质酸（HA）支架，为上皮细胞和脂肪细胞的共培养奠定了生理相关基础。在缺乏重建基底膜（rBM）水凝胶的情况下，支架内形成极化的导管和腺泡结构，再现正常组织形态。此外，类器官的发育结果可由胶原蛋白与HA的比例控制，较高的HA浓度有利于腺泡的形态发育。重要的是，该培养系统概括了干细胞的生态位，因为初级乳腺干细胞形成复杂的类有机物，强调了该方法在使用转基因动物或人类活检材料进行发育和致瘤性研究以及筛选个性化药物的癌症治疗药物方面的实用性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。用3D再现乳腺结构的体外策略。**
(**a、 b条**)小鼠乳腺（妊娠10天）的全量显示，分支上皮被包裹在富含脂肪细胞的脂肪垫内（分别为1mm和200µm条）。高倍免疫组织化学显微照片(**c（c）**)处女腺显示独特的管腔上皮（细胞角蛋白18+）和肌上皮（细胞角蛋白14+）双层结构（bar = 200µm）。相位对比图像(d日)（巴 = 1mm）和S.E.M图像（插入，条 = 200µm）的7.5%HA/col支架，显示相互连接的孔隙，可支持3T3-L1种子和3D培养以及向成熟脂肪细胞分化。(电子)胶原蛋白和7.5%HA/col支架在PBS中浸泡24小时和8个月后的S.E.M图像显示纯胶原蛋白支架中的多孔结构崩溃。(**（f）**)37°C下PBS培养期间通过测量重量保留百分比测定支架的稳定性。(克)3T3-L1种子胶原蛋白支架经过8天的成脂培养。血红素/油红O染色（bar = 200µm）。(小时)接种KIM-2（GFP）48小时和3T3-L1（细胞追踪红）9天（bar）后，厚（<2 mm）胶原支架的横切面 = 500µm）。(我)3T3-L1/KIM-2共培养物（胭脂红染色）在3周时的低倍镜观察显示，分支上皮结构具有钝端（bar） = 200µm）。

**图2。3T3-L1/KIM-2在规定的胶原蛋白/透明质酸支架中共同培养产生双染色的功能性乳腺上皮类器官。**
上皮类器官形成的H&E（a，b）和免疫组织化学（c-o）比较*在体外*带有鼠腺（比例尺 = 50µm，j、o除外 = 30µm）。分支管道示例体内（a）和*在体外*（b、c）。与妊娠5天时的天然腺体一样，上皮类有机物与AQP5（g）和ZO-1（h）向腔腔和整合素β-1（e）以及基底膜成分colIV（l）和层粘连蛋白（m）呈极性。SMA（+）肌上皮细胞围绕管腔上皮细胞（j），具有上皮双层的特征体内（i）。对于产乳stiumuli，类器官腺泡样结构在管腔（o）中表达β-酪蛋白，就像在天然腺体（n）中一样。

**图3。乳腺类器官的命运取决于支架的组成。**
(一)长轴法测定腺泡或导管AQP5（+）/E-cad（+）上皮类器官评分(年)/短轴(x个)比率。(b条)支架组分中HA的加入显著提高了腺泡样到导管样有机物的频率(**c（c）**)在共培养（co）条件下，与单培养（mono）条件下相比，正确的类有机物极性的频率显著提高，并且在HA存在的情况下（ANOVA，*和**代表第页<0.05和第页事后学生T检验分别<0.01，n>3）。(d日)在免疫组织化学制备切片的恒定焦平面上测量的每个类器官E-cad（+）KIM-2的平均数。KIM-2单文化的西方分析(电子)和KIM-2/3T3-L1共同培养(**（f）**)在KIM-2维持培养基（对照）下或在后2周暴露于产乳培养基（产乳）。(克)含15%HA可减少裂解的caspase 3（+）细胞并限制细胞增殖(小时)通过测量总Ki67（+）细胞（*和**表示第页<0.05和第页学生T-Test分别<0.01）。(我)PCR分析*MMP2、MMP3*和*基质金属蛋白酶14*3周KIM-2单培养产乳标本和3T3-L1/KIM-2共培养产乳试样3D支架内的基因表达。(j个)定量实时PCR分析*MMP2、MMP3*和*基质金属蛋白酶14*基因表达标准化为*环磷菌素A*条形图表示一式三份进行的至少3个单独实验的平均值。误差条代表SD。*代表学生T检验的统计显著性(第页<0.05)

**图4。3T3-L1种子胶原蛋白/HA支架支持初级上皮细胞类器官的发育，并提供干细胞生态位。**
(一)在角蛋白14启动子控制下表达GFP标记组蛋白H2B的小鼠乳腺妊娠5天切片。肌上皮/基底谱系的细胞是绿色的，而管腔细胞不表达H2B-GFP。(b条)干细胞富集（GFP+，CD24^医学CD49f型^高的)这些细胞的部分能够在移植到清理过的脂肪垫后使乳腺再生。(**c（c）**)与3T3-L1共培养10天后，原代细胞培养的活细胞共焦图像表示（正交视图和斜投影）显示GFP+细胞在分支器官周围的基本定位。原代上皮类有机物与3T3-L1在纯胶原（d，e）和7.5%HA/col（f）支架中共同培养。有机物形成包裹在基底膜中的导管和腺泡状结构(电子)CK14基底细胞排列在透明管腔周围，管腔上皮细胞在顶端细胞表面正确极化表达ZO-1(**（f）**). (**g、小时**)分类的GFP+标记保留细胞形成菌落，其细胞质孕酮受体（PR）的表达不同，β-连环蛋白阳性(我). (**j、 k个**)菌落显示p63的阳性和阴性染色，表明细胞自我更新或不对称分裂（箭头所示）（条形图 = 100µm）。

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