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.2012年3月;12(2):230-6.
doi:10.1016/j.mito.2011.09.004。 Epub 2011年9月25日。

STED显微镜下心肌线粒体蛋白簇的可视化和定量

附属公司

STED显微镜下心肌线粒体蛋白簇的可视化和定量

哈普雷特·辛格等。 线粒体. 2012年3月.

摘要

用高倍显微镜方法对线粒体相关蛋白进行可视化和定量分析,对于研究该细胞器中的蛋白质结构具有特别重要的意义。我们报告了一种定制的横向分辨率约为30nm的STED荧光纳米显微镜在小鼠心脏经高渗纯化活线粒体蛋白质定位中的应用。使用这种方法,我们能够量化和解析线粒体内不同的蛋白质簇;具体来说,细胞色素c氧化酶亚基2分布在~28nm的簇中;而电压依赖性阴离子通道1则显示出~33、~55和~83nm的三种尺寸分布。

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数字

图1
图1。线粒体组分的纯化与表征
答:。线粒体部分M1、M2和M3显示在30%Percoll梯度中。B。ROS用H测量2O(运行)2-敏感染料amplex红(10μM)。箭头表示在反应介质中添加了心肌线粒体、粗制、M1、M2和M3组分(250μg)和琥珀酸盐(3 mM)。M3而不是M2或M1线粒体组分产生正常数量的ROS作为粗线粒体。C、。全心裂解物(WHL)、粗线粒体(CM)、M1、M2和M3组分的Western blot分析。抗体和蛋白质标记类型在每个印迹中给出。在每条通道上装载等量(50μg)的蛋白质。D。在每个实验中标准化为胭脂红S信号的蛋白质印迹的定量(n=3,除了VDAC1,n=5和Cox2,n=7)。M3线粒体部分富含VDAC1和Cox2,几乎没有其他细胞器标记,包括质膜、高尔基体、内质网、T小管和细胞核。*,M3与WHL显著不同;#M3与CM显著不同(p<0.05)。
图2
图2。共焦显微镜下线粒体蛋白质的可视化
纯化的M3组分线粒体装载有线粒体跟踪器,并对Cox2、VDAC1和Lamin b1蛋白进行反染色。A至B。抗Cox2单克隆抗体和有丝分裂追踪信号。C、。重叠显示了有丝分裂跟踪器和Cox2信号之间的高度相关性。D-E.公司。抗-VDAC1单克隆抗体和有丝分裂追踪信号。F、。D和E的重叠显示了有丝分裂跟踪器与VDAC1的高信号相关性。A“-F”。A-F中的正方形以更高的放大倍数显示,以便更好地进行检查。G-H公司。Lamin b1(核膜标记,阴性对照)和有丝分裂追踪信号。一、。抗-Lamin b1多克隆抗体与有丝分裂跟踪器信号不一致;因此,可以清楚地将污染的核膜碎片与有丝分裂跟踪器负载的线粒体区分开来。G'-I'。G-I中的正方形以更高的放大倍数显示,以便更好地进行检查。J-K公司。线粒体携带有丝分裂跟踪器,并仅用二级抗体标记。二级抗体(抗鼠)无特异性信号(J型)而丝裂原追踪标记是可靠的(K(K))证实线粒体的存在。L。有丝分裂跟踪器对Cox2、VDAC1、Lamin b1或单独二级抗体(Sec-Ab)的蛋白质接近指数(Wu等人,2010),反之亦然(开条)(n=5个线粒体制剂)。文本中给出了值。共聚焦图像以0.0575μm/像素的速度采集。
图3
图3。分离线粒体的STED纳米显微镜显示Cox2和VDAC1簇
纯化的M3线粒体用针对Cox2和VDAC1的单克隆抗体标记。答:。Cox2标记线粒体的共焦图像。B。带有清晰簇的对应STED图像。C、。A和B的叠加突出了STED提高的分辨率。D。C中的正方形被放大以更好地显示。E.公司。B中正方形的放大倍数。F、。E中线条的强度分布标志着一个强度峰值,半高宽约为20 nm和33 nm。G.公司。Cox2的簇大小频率直方图手动拟合为两个高斯分布的和;簇大小峰值分别位于20nm和29nm处。H-I.公司。VDAC1标记线粒体的共焦和STED图像。J。覆盖。英国。放大J中的正方形,突出STED图像和VDAC1簇的分辨率。L。放大倍率为I的正方形。M。L中的线扫描强度分布。箭头标记了FWHM为~33nm的峰值。N。VDAC1的簇大小频率直方图手动拟合为四个高斯分布的和;簇大小的峰值分别位于22、33、55和83nm。n=3个独立的线粒体分离。

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工具书类

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