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.2011年12月;85(24):13038-48。
doi:10.1128/JVI.05834-11。 Epub 2011年10月5日。

淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒核蛋白的C末端区域包含独特的可分离功能域,参与NP-Z相互作用和I型干扰素反应的抵消

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淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒核蛋白的C末端区域包含独特的可分离功能域,参与NP-Z相互作用和I型干扰素反应的抵消

埃米利奥·奥尔蒂兹·里亚尼奥等。 J维罗尔. 2011年12月.

摘要

几种沙粒病毒可导致人类出血热(HF)疾病,该疾病具有较高的发病率和显著的死亡率。沙粒病毒核蛋白(NP)是感染细胞和病毒粒子中最丰富的病毒蛋白,它包裹病毒基因组RNA,这种NP-RNA复合物与病毒L聚合酶一起形成病毒核糖核蛋白(vRNP),指导病毒RNA复制和基因转录。感染性沙粒病毒后代的形成需要将vRNP包装成萌芽颗粒,这一过程中沙粒病毒基质样蛋白(Z)起着核心作用。在本研究中,我们对原型沙粒病毒淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒(LCMV)的NP-Z相互作用进行了表征。与Z相互作用的LCMV NP结构域与之前记录的抵消宿主I型干扰素(IFN)反应的C末端结构域重叠。然而,我们发现,影响LCMV NP抗IFN功能的单个氨基酸突变并没有破坏NP-Z的相互作用,这表明在NP的C末端区域内,不同的氨基酸残基对这两种不同且可分离的NP功能起着关键作用。HF沙粒病毒拉沙病毒(LASV)也证实了类似的NP-Z相互作用。值得注意的是,LCMV NP与LCMV Z和LASV Z的相互作用类似,而LASV NP仅与LASV Z.相互作用。我们的结果还表明,NP中存在一个保守的蛋白质结构域,但特定的氨基酸残基在确定NP-Z相互作用的特异性方面起着关键作用,这可能会影响重配型砂型病毒的生存能力。此外,这种NP-Z相互作用是抗病毒药物开发的潜在靶点,以对抗人类致病性沙型病毒。

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数字

图1。
图1。
LCMV NP-Z相互作用。(A) LCMV NP和Z WT蛋白分别融合到VP16和GAL4的示意图,用于M2H分析系统检测NP-Z相互作用。LCMV NP和Z分别融合到VP16(NP-VP16)和GAL4(GAL4-Z)的N端和C端结构域。M2H分析中的(B和C)LCMV NP-Z相互作用。293T细胞(12孔格式)与2μg NP-VP16和GAL4-Z pCAGG表达质粒、1μg双报告质粒pG5-GFP/Luc(检测蛋白-蛋白质相互作用)和0.1μg SV40-Renilla荧光素酶表达载体pRL SV40(标准化转染效率)共转染。将GAL4和VP16表达质粒作为对照,以证明LCMV-NP-Z相互作用的特异性。转染48小时后,使用荧光显微镜(B)和制备的细胞提取物评估GFP的表达,并使用双荧光素酶报告分析测定相互作用的强度。每个图像中都显示了肾素荧光素酶值(平均值±标准偏差)。显示阴性对照物(NP-VP16加GAL4)上的折叠感应(C)。荧光素酶活性用双荧光素素酶报告分析测定。报告基因激活表现为阴性对照(pCAGGs NP-VP16-和pCAGG GAL4-转染细胞)的折叠诱导。
图2。
图2。
使用BiFC分析检测LCMV-NP-Z相互作用。(A) 融合到N末端(EYN)和C末端(EYC)YFP的LCMV NP和Z蛋白的示意图。(B) 蛋白质表达水平。用检测YFP N端和C端区域的抗GFP多克隆抗体(α-GFP)制备转染所示质粒的293T细胞的细胞裂解液,并通过Western blotting进行分析。GAPDH被用作负荷控制。左侧显示了蛋白质分子质量标记(kDa)。(C) YFP荧光的重建。MDCK细胞与1μg所示质粒组合共转染(24孔板格式)。转染后24小时,细胞在30°C下培养3小时,以使YFP成熟。用荧光显微镜(YFP)和仅识别重组GFP或YFP(α-GFP)的抗GFP单克隆抗体检测YFP的重组,并显示细胞核的DAPI染色和合并图像。显示了具有代表性的图像。放大倍数,×63。棒材,10μm。
图3。
图3。
LCMV NP和Z蛋白的亚细胞共定位。(A) NP-Z在转染细胞中的共定位。将Vero细胞与1μg所示质粒共转染。使用空的pCAGG质粒使单个质粒转染正常化。转染后48小时,用抗HA(α-HA)单克隆抗体(NP染色)和抗FLAG(α-FLAG)多克隆抗体(Z染色)进行免疫荧光染色。细胞核用DAPI染色。合并和放大的正方形如图所示。(B) LCMV感染细胞中的NP-Z共定位。Vero细胞被模拟或LCMV感染(MOI=0.1)。在48 hpi时,使用抗NP(α-NP)单克隆抗体(1.1.3)和抗Z(α-Z)多克隆抗体评估NP和Z的亚细胞定位。图中还显示了NP(绿色)、Z(红色)和DAPI(蓝色)染色的合并图像以及所示正方形的放大图像。显示了具有代表性的图像。放大倍数,×63。棒材,5μm。
图4。
图4。
NP-Z相互作用不需要LCMV NP的N端300氨基酸。(A) M2H分析系统中使用的LCMV NP野生型和N末端缺失突变体的示意图。野生型和NP缺失突变体的总氨基酸长度如右图所示。(B) LCMV NP-Z与N末端缺失突变体的相互作用。共转染细胞(293T),如图1图例所示,量化细胞裂解液中NP-Z相互作用的存在。根据野生型NP-Z相互作用计算N-末端缺失突变体的相互作用百分比。(C) LCMV NP N末端缺失突变体的蛋白表达水平。使用抗VP16(α-VP16)多克隆抗体通过Western blotting分析转染293T细胞的细胞裂解液的蛋白表达水平。GAPDH被用作负荷控制。左侧显示了蛋白质分子质量标记(kDa)。
图5。
图5。
LCMV NP的C末端结构域参与NP-Z相互作用。(A) M2H分析系统中使用的LCMV NP C末端缺失突变体的示意图。野生型和NP C末端缺失突变体的总氨基酸长度如右图所示。(B) NP C末端在LCMV NP-Z相互作用中的作用。293T细胞与所示质粒共转染,NP-Z相互作用在细胞裂解液中定量,如图1图例所示。根据野生型NP-Z相互作用计算C-末端缺失突变体的相互作用百分比。(C) LCMV NP C末端缺失突变体的蛋白表达水平。实验所用的相同细胞提取物(结果如面板B所示)被用于使用多克隆抗VP16(α-VP16)抗体通过Western blotting检测LCMV NP野生型和C末端缺失突变体的表达。GAPDH表达水平用作负荷控制。左侧显示了蛋白质分子质量标记(kDa)。
图6。
图6。
M2H分析中NP-Z相互作用不需要LCMV NP抗IFN功能所需的关键氨基酸残基。如图1图例中所述,共转染293T细胞,但使用指示的LCMV NP IFN突变体。在转染后48小时,通过双核糖核酸酶报告分析定量NP-Z相互作用。(A) 根据野生型NP-Z相互作用计算单个氨基酸突变体的相互作用百分比。(B) LCMV NP突变体的蛋白质表达水平。使用来自实验的相同细胞裂解液(结果如面板A所示),使用抗VP16(α-VP16)多克隆抗体通过Western blotting检测LCMV NP野生型和单氨基酸突变体的表达。GAPDH表达水平作为负荷对照。蛋白质分子量标记(kDa)显示在左侧。
图7。
图7。
通过M2H测定方法评估LCMV和LASV之间的同型和异型NP-Z相互作用。如图1图例所示,将293T细胞与所示的LCMV、LASV NP和Z哺乳动物双杂交表达质粒共转染。转染后48小时,通过荧光显微镜(A)检测GFP表达,检测同源和异源NP-Z蛋白相互作用。GAL4和VP16表达质粒作为阴性对照。每个图像中都显示了肾素荧光素酶值(平均值±标准偏差)。为了量化相互作用,制备细胞裂解物以检测荧光素酶的表达,如图1图例所示。(B) 异源NP-Z相互作用的相互作用百分比根据同源相互作用(B)进行归一化。
图8。
图8。
同源和异源NP并入LCMV和LASV Z诱导的VLP。293T细胞(6孔板格式)与2μg指示的LCMV或LASV NP(HA标记)和Z(FLAG标记)pCAGs表达质粒共同转染。在所有情况下,都包括空的pCAGs-MCS质粒,以使转染DNA的数量正常化。在转染后72小时,制备细胞提取物并分析蛋白质表达水平(输入)。来自相同转染的上清液用于分离VLP。使用抗HA(α-HA)单克隆抗体(NPs)或抗FLAG(α-FLAG)多克隆抗体(Zs)通过Western blotting检测不同沙型病毒NPs和Zs的表达水平。GAPDH被用作负荷控制。每个Western印迹条带底部的数字表示带强度,以同源NP或Z表达水平的百分比表示。
图9。
图9。
评估同型和异型NP-Z共定位。如图3图例所示,将Vero细胞与所示的蛋白表达质粒进行共转染(左)。在转染后48小时,细胞被固定并渗透,然后用抗HA(α-HA)单克隆抗体(NPs)和抗FLAG(α-FLAG)多克隆抗体(Zs)进行免疫荧光。图中显示了NP(绿色)、Z(红色)和DAPI(蓝色)染色的合并图像以及合并的放大图像。显示了具有代表性的图像。放大倍数,×63。棒材,5μm。
图10。
图10。
LCMV NP功能域。LCMV NP一级结构的示意图表示蛋白质功能相关的结构域(顶部)和相互作用(底部)。根据微基因组报告检测结果,LCMV NP的整个一级序列需要用于复制和转录,但最后5个氨基酸除外(38)。N末端结构域(氨基酸1至358)包含参与自结合的区域(47)。C末端结构域包含负责抵消IFN反应的区域(氨基酸370到553),包括DIEGR基序(矩形)(38)和3′-5′核酸外切酶基序(红色)的催化位点(25,54),以及与LCMV Z相互作用的区域(胺基酸350到553。

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引用人

工具书类

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