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.2011年9月21日；31(38):13546-61.
doi:10.1523/JNEUROSCI.2781-11.2011。

神经末梢烟碱型乙酰胆碱受体通过激活轴突T型（Cav3）Ca²，启动体周中间神经元的量子GABA释放+通道和Ca²+从商店释放

艾慧汤 1, 米兰达·A·卡森, 丹尼尔·纳戈德, J迈克尔·麦金托什, 维克托·恩·尤贝尔, 约翰·伦格, 马蒂亚斯·克鲁格曼, 特蕾莎·米尔纳, 布拉德利·E·阿尔杰
附属公司

神经末梢烟碱型乙酰胆碱受体通过激活轴突T型（Cav3）Ca²，启动体周中间神经元的量子GABA释放+通道和Ca²+从商店释放

艾慧汤等。 神经科学. .

摘要

常规神经递质的释放主要由钙（Ca²）控制⁺) 通过动作电位打开的高压激活（HVA）、Ca（v）2、通道（“N-、P/Q-或R-型”）流入。确实发生了阈下去极化对传输的调节，但几乎没有证据表明低电压激活的Ca（v）3（“T型”）通道参与其中。皮层体周靶向中间神经元释放GABA影响许多生理过程，但其潜在的控制机制尚不完全清楚。我们调查了T型Ca²+结合使用全细胞电压灯、多荧光共聚焦显微镜、双免疫电镜和光遗传学方法，通道参与调节大鼠海马CA1中这些细胞的GABA传递。我们发现Ca（v）3.1，T型Ca²+α3β4烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）可激活通道，该受体位于GABA能的体周靶向神经元间轴突的突触区，包括小白蛋白表达细胞。Ca²可以触发异步量子GABA释放+突触前T型钙流入+通道，增加Ca²+在α3β4 nAChRs的焦点微离子导入激活后，从内部存储中提取。由此产生的GABA释放可以抑制锥体细胞。T型Ca²+信道依赖机制不依赖或伴随HVA信道Ca²+对大麻素、μ-阿片类或GABA（B）受体激动剂不敏感。因此，它可以与正常的HVA相关过程并行运行。研究结果揭示了GABA传播调控的新方面，有助于深入了解ACh和尼古丁在中枢神经系统中的作用。

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数字

图1。
图1。
局部ACh应用于体周靶向中间神经元终端时，会在锥体细胞中引发mIPSC爆发。A类，ACh的微离子导入（用痕迹上方的红线表示）在锥体细胞中诱发了突触后电流。顶部面板显示了作为阴性对照的反向离子电泳脉冲的响应。底部面板描述了在生理盐水（黑色）、TTX（红色）和10μ米加巴津（蓝色）。插图说明了TTX中ACh响应的稳定性。时间到峰值的变化(地下一层)和发病时间(地下二层)在TTX应用之前（填充圆圈）和之后（线的开口端），响应与综合ACh响应的大小（单位：微微库仑）有关（平均值±SEM）。在本图和所有后续图中，图中的数字表示组大小。C类,D类，通过内源性黄素蛋白荧光的局部变化评估ACh有效作用区域（见材料和方法）。所有实验均在TTX存在下进行。C1类，ACh在靠近记录的锥体细胞（用黑色虚线表示）的位置传递时，诱导mIPSC爆发，并在细胞附近的一个小区域（红色区域）内黄蛋白荧光显著增加。指挥与控制，ACh的输送距离为50μm，与C1类未能引起细胞附近GABA释放或固有荧光的改变。对连续三次试验的图像进行平均**第页< 0.01.D类，图像显示荧光变化的分布（ΔF类)ACh诱导之前、期间和之后F类峰。下面的红色和黑色痕迹表示平均值F类分别位于红色和白色框内。E类, ΔF类在10μ米机械。F类，组数据；Mec阻断ACh诱导的黄素蛋白ΔF类.
图2。
图2。
ACh诱发的GABA释放依赖于α3β4 nAChR的激活。A类，10μ的影响示例米尼古丁对ACh诱发的mIPSC爆发的影响。B类，选择性α3β4 nAChR阻滞剂α-芋螺毒素AuIB（3μ米)，以及随后添加α7 nAChR阻断剂MLA（50 n米)ACh诱发的mIPSC突发。C类，汇集了显示各种药物对ACh诱导的mIPSC综合爆发的影响的数据。D类，AuIB（3μ米)在没有TTX的情况下，ACh诱发的IPSC爆发。E类，汇集数据显示AuIB可逆阻断ACh诱导的反应*第页< 0.05, **第页< 0.01.
图3。
图3。
ACh诱发的GABA释放依赖于T型钙的开放2+频道。A类,B类米贝地尔（5μ米，蓝色）(A类)或特定的T型钙2+通道拮抗剂TTA-P2（3μ米，绿色）(B类). T型钙2+镍阻塞通道2+米贝地尔和TTA-P2降低了总电荷，延迟了ACh诱发的mIPSC爆发的开始和峰值时间，并降低了初始上升斜率(D类).C类不同[K存在时的ACh诱发反应+]o（o）浓度。对基线进行了调整，以便于比较。E类，减少[K+]o（o）增加总电荷，加速峰值时间，增强ACh诱发的mIPSC脉冲的初始上升斜率。高程[K+]o（o）产生了相反的效果。F类ACh诱发的mIPSC爆发对钙拮抗剂不敏感V（V）钙的2个通道（CgTX，ω-芋螺毒素GVIA；AgTX，Ω-琼脂毒素IVA；SNX，SNX 482）或激动剂V（V）1个地震道（Bay K，Bay K8644；FPL，FPL 64176）。G公司，T型Ca2+通道阻断对ACh诱发反应峰值出现之前（红区填充）或之后（黄区填充）的抑制程度相同。组数据(n个=23）对于实验，如G公司（左）。H1至H3、黄酮蛋白荧光信号（ΔF类)被T型钙堵塞2+通道拮抗剂。上半年，ACh诱导Δ的图像F类处于控制状态（顶部）和TTA-P2（底部）。氢气，平均ACh诱导ΔF类变化减少了100μ米镍2+或3μ米TTA公司。人3，Δ区域面积F类>1被镍还原2+或TTA*第页< 0.05; **第页< 0.01.
图4。
图4。
钙v（v）3.1通道在CA1锥体的PV轴突上表达。A1类，海马Cav（v）3.1免疫染色（4倍放大）。A2类，加利福尼亚州v（v）3.1免疫标记被免疫前肽的吸收所阻断。比例尺，200μm。B–D类PV（过氧化物酶）和Ca的电子显微照片v（v）金字塔状链球菌3.1（免疫金）标记图谱。S、 Soma，D，枝晶，T，末端。比例尺，500 nm。地下一层,地下二层，双标轮廓与锥体相吻合。C1类,指挥与控制，加利福尼亚州v（v）3.1标记的端子在树突上形成突触接触（箭头）。第1页,D2类，双标记终端在锥体细胞轮廓上形成突触接触（箭头）。E1–E3级，Tau1标记的轴突（红色）含有Cav（v）3.1-免疫活性斑点（绿色）。结构内有两个大型泪点(E2级,E3公司，箭头），其中一个位置相近（*）。第4页，Tau1标记的轴突也含有突触素（SYP）免疫反应性（浅蓝色）。Ca公司v（v）3.1未包含在Tau1标记轴突中的点状突起可能位于邻近的躯体（细胞核DAPI染色，深蓝色）。一层楼,地上二层，与相同E2级和E3公司，旋转至平面90°（注意插图的旋转x–z轴坐标）。钙v（v）3.1-即使在旋转的情况下，轴突内也有免疫活性斑点。比例尺：E类,F类，1微米。
图5。
图5。
nAChR介导的mIPSC依赖于储存的Ca2+与Ca松散耦合2+增加。MLA（50个米)在所有实验中持续应用，以分离非α7 nAChR介导的反应。A类，细胞内钙的消耗2+通过thapsigargin（TG）储存（10μ米)（25分钟；蓝色轨迹）与对照组（黑色轨迹）相比，ACh诱发的mIPSC爆发减少。B类ryanodine（Ryn）阻断RyRs（100μ米)（绿色轨迹）减少ACh诱发的mIPSC爆发。C类，Ca的分组数据2+存储实验。D类，ACh诱发的mIPSC爆发被浴用EGTA-AM（100μ米持续10分钟；红色痕迹）。E类EGTA-AM（红色示踪）可减少ACh诱导的无TTX反应，但未完全阻断。其余IPSC被DAMGO阻止（1μ米)（蓝色痕迹）。F类，EGTA-AM对nAChR介导反应的影响总结。请注意，EGTA-AM可消除动作电位非依赖性mIPSC爆发，但不能消除动作电位依赖性释放，而μOR激活可消除这种释放*第页< 0.05, **第页< 0.01,##第页EGTA-AM组<0.01。
图6。
图6。
nAChR诱导的mIPSC爆发对GPCR抑制有抵抗力。A类，在没有TTX的情况下，DAMGO（1μ米)（绿色）ACh诱导的反应减少，表明激活μOR可以抑制ACh诱发的动作电位依赖的GABA释放。B类，突触后锥体细胞的去极化，释放内源性大麻素并激活突触前CB1Rs对ACh诱发反应无影响（蓝色）。DAMGO仍然降低了响应（绿色轨迹）。C类，将实验数据分组，如中所示A类和B类.D类在TTX存在下，nAChR诱导的mIPSC爆发对巴氯芬（2μ米)，DAMGO（1μ米)，或WIN 55212-2（2μ米)GABA激动剂B类Rs、μor或CB1Rs。通过DSI方案释放内源性大麻素（将PC去极化至0 mV 5 s）也没有效果。E类，将实验数据分组，如中所示D类. **第页< 0.01.
图7。
图7。
ACh诱导的GABA释放抑制锥体细胞放电；所有实验中都没有TTX。A类，通过向锥体细胞注入去极化电流诱发的动作电位（蓝色迹线；ACh−）。在锥体细胞去极化前，1秒ACh应用时间为0.5秒。ACh大大延迟了动作电位放电的开始（红色痕迹；ACh+）。MLA逆转了ACh效应（50 n米)加上机械（1μ米)（底部红色轨迹；ACh+）。D类6表示ACh脉冲（ACh+）后电流注入引起的第六动作电位出现与控制中出现（ACh-）之间的时间。MLA+Mec已废除D类6.B类，由典型电池的长时间去极化电流脉冲引起的动作电位放电的发生曲线，如A类在控制溶液或Mec+MLA中交替追踪之前交付.ACh。该图是通过从给定细胞的试验中提取动作电位来构建的。发生的时间n个由去极化脉冲单独诱发的系列动作电位（ACh−；蓝色迹线A类)根据n个在应用ACh（ACh+；红色痕迹A类). 也就是说，在接下来的试验中，不使用ACh的第一动作电位出现的时间与使用ACh后第一动作电位发生的时间成对出现，第二动作电位与第二动作电压成对出现等。每个动作电位对由一个点表示，该点在去极化开始后（时间0）根据其发生时间绘制；在同一试验中，代表动作电位对（ACh−，ACh+）的点通过线连接。在去极化开始后同时发生的动作电位对沿着一条斜率为1的线穿过原点（黑点）下降。在控制溶液中ACh+响应期间，动作电位触发被系统延迟；然而，Mec加MLA防止了延迟，并且点（灰色点和线）散布在黑色虚线周围。在这两种情况下，线的斜率是相同的，这表明延迟不是由突触后细胞特性的变化引起的。C类，组数据显示ACh诱导的D类MLA加Mec或加巴静使数值降至接近零*第页< 0.05.
图8。
图8。
光刺激ChR2表达的PV表达细胞，可从局部应用ACh激活的同一轴突释放GABA。A类，加利福尼亚州V（V）3.1-免疫活性斑点（绿色）出现在CA1层锥体内用突触素（蓝色）标记的PV（红色）轴突上。B类，与相同A类旋转90°进入平面；见插图x–z轴协调。钙v（v）3.1点位于PV轴突内，与旋转角度无关，表明PV和Cav（v）3.1标签是并置的，而不仅仅是紧密并置的。比例尺，1μm。C类，在PV-Cre小鼠CA1区ChR2-mCherry（红色）的表达。对切片进行PV（绿色）免疫染色，以确认PV细胞中ChR2-mCherry的表达（合并图像）。D类，ACh诱发和光诱发的相互作用，动作电位依赖性GABA释放。在控制条件下，单个光脉冲引发大的IPSC（黑色痕迹）；IPSC在右侧扩展。在ACh脉冲之前，光诱发的IPSC减少。从光照前的基线到IPSC峰值测量的光照IPSC。E类，将实验数据分组，如中所示B类; *第页< 0.05.F类，应用程序的顺序与D类：ACh脉冲诱发IPSC爆发（黑色痕迹）。当前导4秒的蓝光脉冲序列（5毫秒，10赫兹）时，ACh诱导的IPSC脉冲包络的积分减小。突发事件从控制中的虚线和轻火车后的实线蓝线整合而成。这两条轨迹都是五次试验的平均值。G公司，将实验数据分组，如中所示F类; *第页< 0.05.
图9。
图9。
内源性ACh引起nAChR依赖性GABA释放。A类在ChAT-Cre小鼠Broca内侧隔/斜带注射AAV-mCherry病毒2周后，海马胆碱能纤维中mCherri的表达。B类，间隔注射6周后CA1胆碱能纤维中ChR2-mCherry的表达。DAPI染色（蓝色）显示细胞核。C类，通过一串蓝光脉冲刺激海马薄片中的胆碱能纤维，在CA1锥体细胞（2μ米肾上腺素，10μ米NBQX，5μ米CGP 78608，20μ米4-AP，2μ米阿托品，50 n米MLA和10μ米DHβE存在）。底部的痕迹显示同一细胞中的光诱发电流减少了10μ米甲胺。D类，与中不同的单元格C类.加巴静（10μ米).E类，基线（预刺激）条件下和列车刺激期间平均IPSC频率的组数据*第页< 0.05.F类，总结本报告结论的示意图模型。
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