Apo- and holo-lactoferrin are both internalized by lactoferrin receptor via clathrin-mediated endocytosis but differentially affect ERK-signaling and cell proliferation in Caco-2 cells

doi:10.1002/jcp.22650

.2011年11月；226(11):3022-31.

doi:10.1002/jcp.22650。

载脂蛋白和全乳铁蛋白均通过氯氰菊酯介导的内吞作用被乳铁蛋白受体内吞，但对Caco-2细胞中ERK信号传导和细胞增殖的影响不同

江汝兰¹, 维罗妮卡·洛佩兹, 香农·L·凯勒赫, 博·伦达尔

附属公司

PMID： 21935933
预防性维修识别码：项目经理3178039
内政部： 2002年10月10日/jcp.22650

载脂蛋白和全乳铁蛋白均通过氯氰菊酯介导的内吞作用被乳铁蛋白受体内吞，但对Caco-2细胞中ERK信号传导和细胞增殖的影响不同

江汝兰等。 J细胞生理学. 2011年11月.

.2011年11月；226(11):3022-31.

doi:10.1002/jcp.22650。

作者

江汝兰¹, 维罗妮卡·洛佩兹, 香农·L·凯勒赫, 博·伦达尔

附属

¹美国加州大学戴维斯分校营养系，加利福尼亚州95616。

PMID： 21935933
预防性维修识别码：项目经理3178039
内政部： 10.1002/jcp.22650

摘要

乳铁蛋白（Lf）是母乳和粘膜分泌物等外分泌液中一种主要的铁结合和多功能蛋白质。Lf的功能似乎取决于Lf蛋白的铁饱和度，并假设通过Lf受体（LfR）的Lf内化来介导。然而，LfR介导肠细胞内吞Lf的机制尚不清楚。我们现在证明了先前从小肠克隆的LfR在人类肠细胞模型（Caco-2细胞）中介导Lf内吞作用。通过细胞表面生物素化在质膜上检测到LfR；在转染了LfR siRNA的细胞中，apo-Lf和holo-Lf的摄取均受到显著抑制。高渗蔗糖和氯氰菊酯siRNA的处理以及与氯氰菊酯接合器AP2共同免疫沉淀LfR表明，LfR通过氯氰介导的内吞作用调节Lf的内吞。虽然无铁Lf（apo-Lf）和铁饱和Lf（holo-Lf。有趣的是，与holo-Lf相比，apo-Lf刺激细胞外信号调节的有丝分裂原活化蛋白激酶（ERK）级联的程度更大，并且apo-Lf诱导的增殖被ERK级联抑制剂（U0126）和网格蛋白siRNA显著抑制，我们的数据表明，LfR是肠细胞摄取Lf的主要途径，其发生独立于通过氯氰菊酯介导的内吞作用的铁饱和度。apo-和holo-Lf的差异效应并不是由于细胞内化机制的差异。

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数字

图1
LRP和LfR均在Caco-2细胞中表达。提取d16 Caco-2细胞的总蛋白，并用抗LRP（A）或LfR（B）进行免疫印迹（50μg/lane）。

图2
LfR而非LRP介导Caco-2细胞中的Lf内吞。（A）受体相关蛋白（RAP）对Caco-2细胞摄取apo-或holo-Lf的影响。D16 Caco-2细胞在37°C下用RAP（50nM）预处理1 h，然后用RAP溶液在含有¹²⁵I-apo-或holo-Lf（100000 cpm/孔）在37°C下保持10分钟。按照材料和方法中的描述测量Lf摄取。数据为平均值±标准差。；n=6。（B）用LfR siRNA（2.0μg/孔）瞬时转染次级流入细胞（40~50%融合）48 h。提取总蛋白并进行免疫印迹。对照和siRNA处理分别显示为+LfR和−LfR。总LfR、105 kDa和35 kDa条带的密度通过Chemi-doc凝胶定量系统（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）进行量化。*与+LfR组相比，P<0.001。（C）对照或LfR抑制细胞与含有¹²⁵I-apo-或holo-Lf（100000 cpm/孔）10分钟，然后按照材料和方法中的描述测量Lf摄取。

图3
Lf对Caco-2细胞膜LfR定位和LfR总丰度的影响。（A） D16 Caco-2细胞经apo-或holo-Lf（3μM）处理或不处理60分钟后，用冰镇PBS冲洗细胞两次。随后，在4°C下用Sulfo-NHSS生物素（0.5 mg/mL，Pierce）将质膜蛋白生物素化1小时。然后用Ultralink-neutravidin珠收集生物素化蛋白并进行免疫印迹。未经生物素处理的细胞被用作阴性对照，以验证蛋白质与Ultralink-neutravidin珠缺乏非特异性结合，这在图中表示为未经核苷酸化的对照。（B）为了确定Caco-2细胞内化apo-/holo-Lf后是否影响总LfR丰度，将d16细胞与载脂蛋白或holo-Lf（3μM）在37°C下孵育60 min，提取总蛋白并进行免疫印迹（50μg/lane）。使用β-actin验证蛋白质载量是否相等。

图4
乳铁蛋白内化由网格蛋白介导，而不是大胞饮作用、微胞饮作用和小窝内吞作用。D16 Caco-2细胞用高渗蔗糖溶液（SFM中0.45 M蔗糖）或细胞松弛素D（SFM中10μM Cyt D）或菲利平（SFM中5μg/mL）在37°C下预处理2小时，然后与含有¹²⁵I标记的Tf或apo-或holo-Lf（每口井100000 cpm）在37°C下保持10分钟。按照材料和方法中的描述测量Lf摄取量。*与对照组相比，P<0.001。

图5
乳铁蛋白内吞依赖于氯氰菊酯。（A）将次级流入细胞（40～50%汇合）瞬时转染有网格蛋白siRNA（1.6μg/孔）24 h。提取总蛋白并进行免疫印迹。对照组表示为+氯菊酯，siRNA处理表示为−氯菊酯。（B）对照组和氯菊酯抑制细胞与含有¹²⁵I-apo-或holo-Lf（100000 cpm/孔）在37°C下保持10分钟，然后测量Lf摄取量。数据为平均值±S.D。；n=6.*与对照组相比，P<0.001。（C）如材料和方法中所述，在Caco-2细胞被apo-或holo-Lf（3μM）处理10分钟（D）和（E）与AP2相关的乳铁蛋白受体处理后，进行共聚焦显微镜检查，以显示LfR与氯氰菊酯的共定位。将D16 Caco-2细胞与载脂蛋白/holo-Lf（3μM）孵育15分钟后，用结合蛋白A/G琼脂糖（25μL）的自适应α（D）和μ2（E）抗体免疫沉淀总细胞裂解物然后用抗adaptinα或μ2进行免疫印迹，以验证相应的抗体是否拉下adaptin a或μ2。然后在室温下将印迹培养在Restore Western Blot Stripping缓冲液中15分钟，封闭1小时，然后用抗LfR抗体重新培养。此外，用正常小鼠IgG（2μg）或与蛋白A/g琼脂糖偶联的鸡IgY（2μg）免疫沉淀总细胞蛋白（500μg），以评估免疫沉淀的特异性。

图6
载脂蛋白和holo-Lf对Caco-2细胞增殖的影响。用apo-或holo-Lf（400μg/mL）处理亚流动细胞（约50%）12小时。通过BrdU增殖试剂盒评估apo-和holo-Lf对细胞增殖的影响。数据为两个独立实验的平均值±S.D；每组n=6。*与对照组相比，P<0.001。

图7
结合和内化动力学¹²⁵Caco-2细胞标记的载脂蛋白和holo-Lf。（A）不同浓度的¹²⁵将I标记的apo-或holo-Lf（1-10μM）添加到D16细胞中，然后在4°C下培养90分钟¹²⁵放射性由γ计数器测定。（B） 24孔细胞培养板中的D16 Caco-2细胞与¹²⁵I标记的apo-或holo-Lf（100000 cpm/孔）在37°C下不同时间（15-90分钟）。细胞内¹²⁵放射性由γ计数器测定。数据为两个独立实验的平均值±标准差；n=6/浓度或时间点。

图8
Apo-和holo-Lf激活ERK信号转导。（A）用载脂蛋白或完整-Lf（400μg/mL）处理亚流入Caco-2细胞（约50%融合）5、10和20分钟。对全细胞裂解物进行SDS-PAGE，并用磷酸化ERK1/2（P-ERK1/2）或总ERK1/2的抗体进行免疫印迹。使用β-肌动蛋白验证等蛋白载量。（B）数据显示了三个独立实验中apo-Lf或holo-Lf处理的磷酸化ERK1/2与总ERK1/2的比率（平均值±S.D.）。0分钟时的比率表示为100%的任意数字。*与apo-Lf治疗相比，p<0.05。（C）评估U0126对载脂蛋白-Lf诱导的增殖的影响。将亚流入Caco-2细胞在37℃用U0126（50μM）预培养30分钟，然后在37℃下用载脂蛋白-Lf（400μg/mL，在含有2%FBS的细胞培养基中）培养12小时。使用BrdU增殖试剂盒评估U0126对载脂蛋白-Lf诱导的增殖的影响。数据为两个独立实验的平均值±S.D；每组n=6。*与对照组相比，P<0.001和**P<0.01。（D）氯氰菊酯抑制对载脂蛋白-Lf诱导增殖的影响。如上所述减弱氯氰菊酯，并通过BrdU增殖试剂盒测定氯氰菊酯抑制apo-Lf诱导的增殖的效果。数据为两个独立实验的平均值±S.D；每组n=6。*与对照组相比P＜0.001。

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