Resveratrol suppresses constitutive activation of AKT via generation of ROS and induces apoptosis in diffuse large B cell lymphoma cell lines

doi:10.1371/journal.pone.0024703

.2011;6（9）：e24703。

doi:10.1371/journal.pone.0024703。 Epub 2011年9月12日。

白藜芦醇通过产生ROS抑制AKT的组成性激活并诱导弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系的凋亡

阿扎尔·侯赛因¹, 沙哈布·乌丁, 荣布, 奥马尔·斯汗, 赛义达·O·艾哈迈德, 马库尔·艾哈迈德, Khawla S Al-Kuraya公司

附属公司

PMID： 21931821
预防性维修识别码：下午371480
内政部： 10.1371/journal.pone.0024703

白藜芦醇通过产生ROS抑制AKT的组成性激活并诱导弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系的凋亡

阿扎尔·侯赛因等。公共科学图书馆一号. 2011.

.2011;6（9）：e24703。

doi:10.1371/journal.pone.0024703。 Epub 2011年9月12日。

作者

阿扎尔·侯赛因¹, 沙哈布·乌丁, 荣布, 奥马尔·斯汗, 赛义达·O·艾哈迈德, 马库尔·艾哈迈德, Khawla S Al Kuraya公司

附属

¹沙特阿拉伯利雅得费萨尔国王专科医院和研究中心人类癌症基因组研究。

PMID： 21931821
预防性维修识别码： PMC3171480型
内政部： 10.1371/journal.pone.0024703

摘要

背景：我们最近发现，PI3-激酶/AKT生存途径的失调在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的发病机制中起着重要作用。为了寻找新的治疗药物，我们研究了白藜芦醇（反式-3,4'，5-三羟基二苯乙烯）的作用，白藜芦醇是一种在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞上的天然多酚化合物，在抑制细胞活性和诱导凋亡方面起到了作用。

方法/主要发现：我们研究了白藜芦醇对DLBCL细胞的作用，发现白藜芦醇通过生成活性氧（ROS）抑制组成性激活的AKT及其下游靶点，从而抑制细胞活性并诱导凋亡。同时，白藜芦醇对DLBCL细胞株的治疗也导致ROS依赖性DR5上调；有趣的是，DLBCL与亚毒性剂量的TRAIL和白藜芦醇联合治疗通过利用DR5协同诱导细胞凋亡，另一方面，DR5的基因沉默消除了这种效应。

结论/意义：总之，这些数据表明，白藜芦醇作为AKT/PKB途径的抑制剂，通过产生ROS导致细胞凋亡，同时通过上调DR5至TRAIL介导的细胞凋亡来启动DLBCL细胞。这些数据增加了白藜芦醇在DLBCL和其他可能具有AKT/PKB通路组成性激活的恶性肿瘤中具有未来治疗作用的可能性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。白藜芦醇抑制DLBCL细胞的生长并诱导其凋亡。**
(A类)DLBCL细胞系与0–100µM白藜芦醇孵育24小时。如材料和方法所述，通过MTT分析测定细胞活力。该图显示了三个独立实验的平均值+/-SD（标准偏差），*p<0.05，具有统计学意义（学生t吨-测试）。(B)用25和50µM白藜芦醇处理SUDHL4、HBL-1和OCILY3细胞24小时，并通过活/死试验测定细胞凋亡。(C类)用25和50µM白藜芦醇处理DLBCL细胞24小时。然后，按照“材料和方法”中的描述，对细胞进行清洗、固定并用碘化丙啶染色，并用流式细胞仪分析DNA含量。(D类)用25和50µM白藜芦醇（如图所示）处理DLBCL细胞24小时，随后用荧光蛋白偶联的膜联蛋白-V和碘化丙啶（PI）对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。

**图2。白藜芦醇抑制DLBCL细胞中构成活性AKT及其下游效应器。**
(A类)用不同剂量的白藜芦醇处理SUDHL4和HBL-1细胞。用Phospho-Akt-Ser473、总Akt Phospho-FOXO1、总FOXO1，p-GSK3、Phospho-Bad和Beta-actin免疫印迹每个样品中等量的蛋白质。(B)用25和50µM白藜芦醇处理SUDHL4细胞24小时。用AKT抗体或IgG以及蛋白A珠溶解细胞并免疫沉淀过夜。孵育后，清洗珠子，并在30°C下用激酶缓冲液和2µl GSK-3蛋白/ATP混合物孵育4小时。煮沸珠子，用抗p-GSK3抗体免疫印迹等量蛋白质。(C类)将SUDHL4和HBL-1细胞加载10µM H2DCFDA 45分钟，然后用25µM白藜芦醇培养指定的时间段。将细胞重新悬浮在PBS中，并通过流式细胞术分析细胞内H2DCFDA的积累(D类)用10µM H2DCFDA负载SUDHL4和HBL-1细胞株45分钟，然后用10mM NAC预处理2小时，然后用50µM白藜芦醇处理不同时间段。将细胞重新悬浮在PBS中，并使用流式细胞术进行分析。条形图显示三个独立实验的平均值+/−SD（标准偏差），*p<0.05，具有统计学意义（学生t吨-测试）。(E类)用10mM NAC预处理SUDHL4和HBL-1细胞2小时，然后用50µM白藜芦醇处理24小时。细胞溶解后，用抗p-AKT和β-肌动蛋白抗体对等量的蛋白质进行免疫印迹，如图所示。

**图3。白藜芦醇诱导的DLBCL细胞线粒体信号通路。**
(A类)用50µM白藜芦醇处理指定时间段后，裂解HBL-1和SUDHL4细胞，并用抗Bax 6A7抗体进行免疫沉淀，以检测构象变化的Bax蛋白。此外，用特异性抗Bax多克隆抗体对总细胞裂解物进行免疫标记。(B)用10mM NAC和80µM z-VAD/fmk预处理HBL-1和SUDHL4细胞2小时，然后用50µM白藜芦醇处理8小时。裂解细胞并用抗Bax 6A7抗体免疫沉淀，用Bax兔多克隆抗体免疫印迹蛋白质。(C类)用25和50µM白藜芦醇处理DLBCL细胞24小时。用JC-1染色法测定线粒体膜电位完整的活细胞和线粒体膜电位丢失的死细胞，并用流式细胞仪进行分析，如材料和方法所述。(D类)用25和50µM白藜芦醇处理SUDHL4和HBL-1细胞24小时。分离线粒体游离细胞溶质部分，并用抗细胞色素c和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。

**图4。白藜芦醇处理诱导DLBCL细胞中caspase-9，-3的激活和PARP的裂解。**
(A类)用25和50µM白藜芦醇处理SUDHL4和HBL-1细胞24小时。对细胞进行裂解，并用抗caspase-9、caspase-3、裂解caspase-3、PARP和Beta-actin的抗体对等量的蛋白质进行免疫印迹。用80µM z-VAD预处理SUDHL4和HBL-1细胞(B)或10mM NAC(C类)2小时，然后用50µM白藜芦醇处理24小时。裂解细胞，并用抗胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3裂解的胱天蛋白酶-3和β-肌动蛋白的抗体免疫印迹等量的蛋白质。(D类)用80µM z-VAD-fmk或10mM NAC预处理SUDHL4和HBL-1细胞2小时，然后用50µM白藜芦醇处理24小时。治疗后，用荧光素结合膜联蛋白V/PI对细胞进行染色，并用流式细胞仪检测细胞凋亡。

**图5。Reservatrol介导的DR5上调。**
(A类)用50µM白藜芦醇处理SUDHL4细胞指定的时间段。细胞溶解后，用抗DR5和β肌动蛋白抗体对等量的蛋白质进行免疫标记。(B)用80µM z-VAD（上面板）或10mM NAC（下面板）预处理SUDHL4和HBL-1细胞2小时，然后用50µM白藜芦醇处理24小时。细胞被裂解，等量的蛋白质被抗DR5和β-肌动蛋白抗体免疫印迹。(C类)将50和100nM siRNA转染SUDHL4细胞，特异性抗DR5或干扰siRNA 48小时。然后用25和50µM白藜芦醇处理细胞24小时，然后用荧光结合的Annexin V/PI对细胞进行染色，并用流式细胞仪进行分析。(D类)用100nM特异性抗DR5的siRNA或扰乱的siRNA转染SUDHL4细胞48小时，并用25和50µM白藜芦醇处理24小时。对细胞进行裂解，并用抗DR5、caspase-3、裂解caspase-2、PARP和β-actin的抗体对等量的蛋白质进行免疫标记。

**图6。白藜芦醇治疗可增强TRAIL介导的DLBCL细胞凋亡。**
(A类)用10µM白藜芦醇处理SUDHL4和HBL-1细胞，在有无1和5ng TRAIL的情况下处理24小时。治疗后，用荧光结合的Annexin V/PI对细胞进行染色，并用流式细胞仪进行分析。(B)在有无1和5ng TRAIL的情况下，用10µM白藜芦醇处理SUDHL4细胞24小时。治疗后，对细胞进行裂解，并用抗caspase-8、caspase-3、PARP和β-肌动蛋白抗体对等量的蛋白质进行免疫标记。(C类)用打乱的siRNA（100nM）或DR5特异性siRNA（100 nM）转染SUDHL4和HBL-1细胞48小时，然后在1或5ng TRAIL存在下用10µM白藜芦醇处理细胞24小时，然后用荧光结合的Annexin V/PI对细胞进行染色，并用流式细胞术进行分析，*表示统计显著性（p<0.05）或(D类)用50µM钙黄绿素AM和8µM乙锭同源二聚体对细胞进行染色，并使用高通滤波器在Olympus荧光显微镜下观察。（E）用打乱的siRNA（100nM）或DR5特异性siRNA（100 nM）转染SUDHL4和HBL-1细胞48小时，然后用0µM白藜芦醇在1或5ng TRAIL存在下处理细胞24小时，随后用DR5和Betaactin抗体对细胞进行裂解和免疫印迹。

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