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.2011年11月；22(21):4171-81.
doi:10.1091/mbc。E11-02-0163。 Epub 2011年9月7日。

染色质重塑器ISWI调节细胞对缺氧的反应：FIH的作用

安德鲁·梅尔文 1, 莎朗·穆迪, 索尼娅·罗查
附属公司

染色质重塑器ISWI调节细胞对缺氧的反应：FIH的作用

安德鲁·梅尔文等。 分子生物学细胞. 2011年11月.

摘要

低氧诱导因子（HIF）是细胞缺氧反应的主要调节因子。其水平和活性由称为脯氨酰羟化酶的双加氧酶和抑制因子HIF（FIH）控制。为了激活基因，HIF必须访问整合在染色质中的DNA序列。众所周知，染色质重塑复合物开关/蔗糖不可发酵（SWI/SNF）对HIF活性至关重要。然而，没有关于其他染色质重塑酶在缺氧中的作用的额外信息。这里我们描述了模拟开关（ISWI）在细胞缺氧反应中的作用。我们发现，与SWI/SNF不同，ISWI耗竭增强HIF活性，但不会改变其水平。此外，ISWI基因敲除只改变HIF靶基因的一个子集。从机理上讲，我们发现通过改变RNA聚合酶II加载到FIH启动子的方式，ISWI是FIH mRNA和蛋白质水平的完全表达所必需的。有趣的是，外源性FIH可以拯救ISWI介导的CA9上调，但不能拯救BNIP3上调，这表明也涉及FIH非依赖性机制。重要的是，ISWI缺失通过减少自噬和增加凋亡来改变细胞对缺氧的反应。这些结果证明了ISWI在细胞对缺氧的反应中作为一种生存因子的新作用。

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数字

图1：
图1：
ISWI缺失导致HIF荧光素酶报告活性增加。（A–D）使用HRE-核糖核酸酶报告质粒在U2OS（A，C）和HeLa（B，D）中生成稳定的细胞系。在每个相应的细胞系中，使用非靶向（NT）、HIF-1α或ISWI siRNA寡核苷酸，同时或不使用低氧血症DFX（200μM，24 h）（A，B）或低氧（1%O）2持续24小时；HPX）（C、D）。数据归一化为DFX或HPX处理的NT样品。（E） 将表达融合荧光素酶的PHD2启动子的稳定细胞系与NT、HIF-1α或ISWI siRNA寡核苷酸一起暴露于DFX。数据归一化为DFX处理的NT样本。（F） 表达NF-κB反应元件的稳定细胞系与荧光素酶融合，用TNF-α处理，并用siRNA寡核苷酸去除RelA或ISWI。对于所有实验，条形图表示至少三个独立生物复制的平均值，误差条形图表示SE。p值使用Student’st吨测试（*p<0.05；**p<0.01；**p<0.001）。（G） 对缺乏HIF-1α和ISWI的U2OS细胞进行Western blot，并用或不用DFX处理，显示HIF-1 a、hSNF2h和肌动蛋白作为负荷对照。
图2：
图2：
缺氧时，ISWI耗竭调节HIF依赖靶的子集。将U2OS细胞暴露于缺氧0、4、8和24 h，收集mRNA并进行逆转录，对指示基因进行实时定量PCR：（A）ISWI，（B）CA9，（C）BNIP3，（D）PHD2，（E）DEC1，（F）Gluto3。U2OS细胞在暴露于1%的氧之前，使用siRNA寡核苷酸耗尽ISWI、HIF-1α或ISWI和HIF-1 a的组合2在24 h内收集mRNA，逆转录并对指示基因（G）BNIP3，（h）CA9进行实时定量PCR。对于所有实验，样品均归一化为肌动蛋白和24小时NT对照。条形图表示至少三个独立生物复制的平均值，误差条形图表示SE。p值使用Student’st吨测试（*p<0.05；**p<0.01；**p<0.001）。
图3：
图3：
ISWI缺失不会改变HIF mRNA或蛋白质水平。（A） U2OS细胞缺氧24小时，HIF-1α或ISWI被耗尽，HIF-1mRNA通过实时PCR定量。将样品标准化为肌动蛋白和NT对照。（B） 用siRNA寡核苷酸去除ISWI后，通过实时PCR定量HeLa HIF-1αmRNA。（C） 用siRNA寡核苷酸去除ISWI后，通过实时PCR定量U2OS HIF-1βmRNA。（D） 与C组相同，但测定了HIF-2αmRNA。条形图表示至少三个独立生物复制的平均值，误差条形图表示SE。p值使用Student’st吨测试（*p<0.05；**p<0.01；**p<0.001）。U2OS（E）和HeLa（F）全细胞裂解物的（E，F）蛋白印迹，显示hSNF2h、HIF-1β、HIF-1α和HIF-2α（l，长时间暴露；s，短时间暴露）和肌动蛋白作为负荷控制。
图4：
图4：
ISWI缺失降低FIH mRNA和蛋白质。U2OS（A）和HeLa（B）细胞系中的siRNA寡核苷酸去除ISWI后的（A，B）FIH（黑色）和ISWI（白色）mRNA。对于所有实验，样品均归一化为肌动蛋白和NT对照。条形图表示至少三个独立生物复制的平均值，误差条形图表示SE。p值使用Student’st吨测试（*p<0.05；**p<0.01；**p<0.001）。（C） Western blot显示hSNF2h、HIF-1α、FIH和PCNA作为U2OS细胞中的负荷控制。（D） Western blot描绘了多个siRNA寡核苷酸对U2OS细胞中ISWI（1-8）的作用。（E） Western Blot描述了hSNF2h过度表达对U2OS细胞中FIH水平的影响。
图5：
图5：
ISWI控制FIH基因的RNA聚合酶负载。使用siRNA寡核苷酸去除U2OS细胞的ISWI。染色质免疫沉淀采用RNA聚合酶II（Pol II）（A）、乙酰化组蛋白H3（AcH3）（B）、组蛋白H4（H3）、二甲基-雌酮H3（Lys36）（2MeK36）（D）和三甲基-雌酚H3（Lys36）。通过实时定量PCR测量抗体和富集度，并将其归一化为输入和控制siRNA。条形代表至少三个独立生物复制的平均值，误差条形代表SE。P值使用Student’st吨测试（*p<0.05；**p<0.01；**p<0.001）。
图6：
图6：
FIH耗竭对HIF靶基因的影响。（A） 使用siRNA寡核苷酸对HIF-1α或ISWI缺失的U2OS全细胞裂解产物进行Western blot，并用去铁沙明处理24小时2（C）使用siRNA寡核苷酸和/或在1%氧浓度下缺氧24小时（HPX）处理U2OS全细胞裂解物的Western blot2（D）U2OS细胞首先转染对照或ISWI siRNA，24小时后转染FIH过表达（pFIH）。在初始转染后48小时，将细胞暴露于缺氧（HPX）中，在1%O下再暴露24小时2使用所示抗体对全细胞裂解物进行蛋白质印迹。（E） U2OS在暴露于1%O的24小时前转染对照组和hSNF2h（phSNF2h）表达结构2使用所示抗体进行蛋白质印迹。（F） U2OS在暴露于1%的O中24小时前转染对照组和BNIP3 siRNA寡核苷酸2使用所描述的抗体进行蛋白质印迹。箭头表示特定的BNIP3波段。如有指示，可使用ImageJ软件进行带强度的密度分析。样品归一化为肌动蛋白和24小时NT对照，E除外，其中hSNF2h和FIH归一化成NT。
图7：
图7：
ISWI控制缺氧时BNIP3和CA9基因的转录和mRNA稳定性。使用siRNA寡核苷酸去除U2OS细胞的ISWI，并用1%O处理2持续24小时。使用RNA聚合酶II（Pol II）（A，B）或乙酰化组蛋白H3（AcH3）（C，D）对BNIP3（A，C）和CA9启动子（B，D）进行染色质免疫沉淀。通过实时定量PCR测量抗体和富集度，并将其归一化以输入和控制siRNA。（E，F）U2OS细胞通过siRNA耗尽ISWI，以非靶向siRNA作为对照，暴露于低氧（1%O224小时，并用10μg/ml放线菌素D处理缺氧处理的最后（0、4或8）小时。提取mRNA并逆转录，对CA9（E）和BNIP3（F）进行qPCR。将所有样本归一化为肌动蛋白，然后对NT和ISWI siRNA进行放线菌素处理0小时。数据点表示至少三个独立生物复制的平均值。条形图表示至少三个独立生物复制的平均值，误差条形图表示SE。p值使用Student’st吨测试（*p<0.05；**p<0.01；**p<0.001）。
图8：
图8：
ISWI缺失改变细胞增殖和低氧诱导的自噬。（A） 用对照（NT）或ISWI siRNA寡核苷酸转染U2OS细胞，24小时后将细胞暴露于缺氧或常压，并在缺氧0、24和48小时通过自动细胞计数器进行计数。点表示至少三个独立生物复制的平均值，误差条表示SE。p值使用Student’st吨测试（*p<0.05）。（B） 与A组一样，但用台盼蓝染色法分析细胞活力。（C） 用非靶向或ISWI siRNA寡核苷酸转染U2OS细胞，并暴露于缺氧24小时（1%O2). 使用所示抗体对样本进行Western blot分析。箭头表示劈开的LC3。（D） 在缺氧24小时之前，用NT或ISWI siRNA转染稳定表达GFP-LC3质粒的U2OS细胞。固定细胞并通过显微镜分析GFP-LC3foci。
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