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.2011年10月11日;50(40):8682-91.
doi:10.1021/bi2010366。 Epub 2011年9月20日。

改良稳定性和功能的工程链霉亲和素单体和二聚体

附属公司

改良稳定性和功能的工程链霉亲和素单体和二聚体

Kok Hong Lim公司等。 生物化学. .

摘要

虽然链霉亲和素对生物素的高亲和力使其成为广泛应用和研究的结合蛋白和标记工具,但其四聚体结构可能会干扰某些分析。具有更简单四级结构的链霉亲和素突变体将在分子水平上展示对其结构组织的理解,并导致开发新的分子试剂。然而,在不破坏生物素结合的情况下调节四聚体结构是极其困难的。在本研究中,我们描述了体内外结合生物素的稳定单体的设计。为此,我们构建并表征了含有合理设计突变的单体。突变提高了单体的稳定性(T(m)从31℃增加到47℃)及其亲和力(K(d)从123 nM增加到38 nM)。我们还使用稳定性改进的单体构建了由两个链霉亲和素亚基组成的二聚体,它们在二聚体界面上相互作用,我们称之为a/D二聚体。生物素结合囊在四聚体和A/D二聚体之间是保守的,因此,二聚体预计具有比单体更高的亲和力。二聚体(K(d)=17 nM)的亲和力高于单体,但仍比野生型四聚体低许多数量级,这表明还有其他因素对高亲和力生物素结合很重要。我们表明,通过标记显示生物素化受体的细胞,工程链霉亲和素单体和二聚体可以在体内选择性结合生物素化靶点。因此,所设计的突变体可能有助于新的应用以及在未来研究中阐明寡聚化在链霉亲和素功能中的作用。

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