The D153del mutation in GNB3 gene causes tissue specific signalling patterns and an abnormal renal morphology in Rge chickens

doi:10.1371/journal.pone.0021156

.2011;6（8）：e21156。

doi:10.1371/journal.pone.0021156。 Epub 2011年8月22日。

GNB3基因D153del突变导致Rge鸡组织特异性信号模式和肾脏形态异常

赫曼斯·图马拉¹, 斯图尔特·弗莱明, 保罗·M·霍金, 丹尼尔·维纳, 扎希德·纳西姆, 马尼尔·阿里, 克里斯托弗·英格亨, 尼古拉·哲列夫, 道格拉斯·莱斯特

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GNB3基因D153del突变导致Rge鸡组织特异性信号模式和肾脏形态异常

赫曼斯·图马拉等。公共科学图书馆一号. 2011.

.2011;6（8）：e21156。

doi:10.1371/journal.pone.0021156。 Epub 2011年8月22日。

作者

血红细胞瘤¹, 斯图尔特·弗莱明, Paul M冰球, 丹尼尔·维纳, 扎希德·纳西姆, 曼尼尔·阿里, 克里斯托弗·英格亨, 尼古拉·哲列夫, 道格拉斯·莱斯特

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¹英国苏格兰邓迪阿伯泰邓迪大学当代科学学院。

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摘要

背景：GNB3基因在脊椎动物的视锥细胞而非视杆细胞感光器中表达，在颜色视觉传导过程中充当β转导蛋白亚基。GNB3基因中一个自然发生的突变“D153del”会导致鸡的隐性遗传致盲型视网膜病变全球扩大（rge）病。然而，GNB3也在大多数其他脊椎动物组织中表达，这表明D153del突变可能产生眼睛无法看到的病理效应。

主要发现：用正常和突变重组GNB3构建物转染COS-7细胞并进行环己酰亚胺追踪的重组研究表明，突变GNB3d蛋白的半衰期比正常GNB3短得多。GNB3编码Gβ3蛋白亚基，与不同的Gγ和Gα亚基一起激活和调节不同组织中的磷酸化级联。正如预期的那样，cGMP和cAMP次级信使及其活化激酶（如MAPK、AKT和GRK2）的相对水平也被发现在大型鸡中以组织特异性的方式显著改变。对rge纯合子感染鸡肾脏组织切片的组织化学分析表明，鸡的肾小球囊增大，导致肾小球增大和肾小管间质炎症，而其他组织（大脑、心脏、肝脏、胰腺）未受影响。

意义：这些发现证实了GNB3基因中的D153del突变以GNB3蛋白为靶点进行早期降解。缺乏GNB3信号导致ERK2和AKT磷酸化活性降低，导致大型鸡出现严重的病理表型，如失明和肾脏异常。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。正常和突变GNB3蛋白的差异定位。**
用表达GNB3YFP（图1a-d）和GNB3dYFP的重组构建物瞬时转染COS-7细胞（图1e-h）。表达GNB3的细胞显示ER和高尔基体定位（1i&j）。表达GNB3d突变蛋白的细胞显示出对ER的主要定位（图1k），但在高尔基体中没有（图1l）。与GNB3YFP（图1m）相比，质膜染色显示GNB3dYFP没有共定位（图1n）。这些是在40倍物镜和1.5倍放大倍数下从不同视野拍摄的代表性图像。酒吧 = 8微米。

**图2。GNB3降解测定。**
环己酰胺处理后不同时间点COS7细胞中GNB3YFP和GNB3dYFP的相对降解，并针对定制的GNB3抗体进行了探讨。这些图表代表了总共三个独立实验，每个单独时间点的相关读数均归一化为同一印迹上内源性GNB3的密度测定单位。

**图3。鸡关键组织中GNB3蛋白的表达。**
GNB3对D153del感染的（rge）和正常组织（wt）蛋白提取物的免疫反应性用抗-GNB3印迹，然后对D153del感染的混合组织样品进行定量密度分析（n = 8）年龄相同。所有面板中显示的数据均为平均值，标准误差（条）为n = 3个独立实验。统计显著性显示为*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

**图4。cGMP和cAMP在大型鸡组织中的差异调节。**
一)与未受影响的对照组相比，受D153del影响的视网膜中cGMP水平的组织特异性调节表现为显著增加，但其他D153del组织中的cGMP含量减少。数据是n的平均值和标准误差（条） = 在八胞胎中进行3个独立实验。统计显著性显示为*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。b条)与正常对照组相比，受D153del影响的视网膜和脑样本中cAMP水平的组织特异性调节显著增加，而受D153del影响的心脏、肝脏和肾脏的cAMP浓度则下降。数据为平均值，标准误差（bar）为n = 在八胞胎中进行3个独立实验。统计显著性显示为*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

**图5。GNB3控制的cAMP调节GRK2磷酸化活性。**
与wt对照组相比，受D153del影响的视网膜、大脑、心脏、肝脏和肾脏中GRK2的磷酸免疫反应性在rge鸡蛋白提取物中表现出组织特异性变化。实验共有n个 = 3个独立实验。统计显著性显示为*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

**图6。缺乏ERK2和AKT磷酸化。**
D153del中ERK2和AKT的磷酸免疫反应性影响视网膜、脑、心、肝和肾。突变体*rge公司*与正常年龄匹配的对照组相比，鸡蛋白提取物的相对磷酸化活性发生了显著变化，这一点通过半定量密度分析得到了证实。实验共有n个 = 3独立实验。统计学显著性表现为*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

**图7。rge鸡肾脏切片的组织病理学研究。**
突变肾的肾小球（图7a）比野生型肾小球大得多（图7b）；而小管的直径大致相同。肾小管管腔内可见大量红细胞，存在的地方与肾小管上皮的扁平化损伤有关（图7c和d）。这些红细胞在野生型肾脏中未见（图7b、d和f）。在rge中有一个由淋巴细胞和巨噬细胞浸润小管组成的严重肾小管间质炎症灶（下箭头），在wt肾脏中未见。放大66倍。

**图8。肾脏切片中GNB3的主要表达。**
肾脏切片上GNB3（绿色）的免疫组织化学显示，正常肾脏的小管、近曲小管（PCT）和肾小球（GL）的上皮边界高表达（图8a），而在大切片上不太明显（图8b）。在rge和wt切片中观察到COX IV抗原（红色）的阳性对照染色（图8c和8d）。这些数字代表了在三个单独的实验中从不同视角拍摄的不同图像（n = 3). 放大60倍。

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