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.2011;6（8）：e23504。
doi:10.1371/journal.pone.0023504。 Epub 2011年8月19日。

dystrophin Dp71的敲除损害PC12细胞周期：纺锤体和胞质分裂结构中的定位暗示Dp71在细胞分裂中的作用

马塞拉·维拉雷尔·席尔瓦 1, 费德里科·森特诺·克鲁斯, 罗西奥·苏亚雷斯-桑切斯, 埃夫拉·加里多, 布尔马罗·西斯内罗斯
附属公司

dystrophin Dp71的敲除损害PC12细胞周期：纺锤体和胞质分裂结构中的定位暗示Dp71在细胞分裂中的作用

马塞拉·维拉雷尔·席尔瓦等。 公共科学图书馆一号. 2011.

摘要

肌营养不良蛋白Dp71在神经元细胞中的功能尚待确定。此前，我们通过分离和鉴定Dp71缺失的PC12神经元细胞，揭示了该蛋白参与神经生长因子（NGF）诱导的神经元分化和细胞粘附。在这项工作中，对Dp71敲除细胞的一种新表型进行了表征，即其延迟生长率。细胞周期分析显示，Dp71缺失细胞的行为发生了改变，包括G0/G1转变延迟和诺卡唑诱导的有丝分裂阻滞期间凋亡增加。Dp71与层粘连蛋白B1和β-dystroglycan相关，后者是参与细胞分裂周期的蛋白质；因此，我们通过免疫荧光和共聚焦显微镜分析比较了Dp71、层粘连蛋白B1和β-dystroglycan在PC12细胞有丝分裂和胞质分裂时的分布。这三种蛋白均显示出类似的免疫染色模式，定位于有丝分裂纺锤体、分裂沟和中体。值得注意的是，在Dp71缺失细胞中观察到层粘连B1和β-dystroglycan在有丝分裂纺锤体、分裂沟和中体中的染色都急剧减少。此外，我们通过免疫沉淀和下拉分析证明了Dp71与PC12细胞中层粘连蛋白B1的相互作用，重要的是，我们揭示了Dp71表达的敲低导致层粘连蛋白B1水平的显著降低和核膜蛋白emerin的定位改变。我们的数据表明，Dp71是有丝分裂纺锤体和胞质分裂多蛋白装置的一个组成部分，可能通过影响层粘连B1和β-dystroglycan水平来调节细胞分裂周期。

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数字

图1
图1。敲低Dp71表达降低PC12细胞的增殖。
用抗Dp71抗体2166通过蛋白质印迹法测量不同Dp71缺失克隆（AS1–AS6）中的Dp71蛋白水平，并与PC12细胞和对照细胞（对照）的Dp71蛋白水平进行比较。剥离膜，并用抗肌动蛋白抗体重制膜，以使其正常化。蛋白质标记物的迁移如右图（A）所示。通过通过tripan蓝排斥法（B）或MTT分析法（C）直接计数活细胞，并在培养2天后通过流式细胞仪（D）掺入BrdU，监测对照组和AS1、-2和-5细胞在5天内的细胞增殖。数据表示为三个独立实验的平均值±标准平均误差（SEM）。面板D中的星号表示显著差异(第页<0.05).
图2
图2。Dp71缺失的细胞显示出改变的细胞周期轮廓和延迟的G1-S转换。
对照细胞和Dp71敲除细胞（克隆AS1、-2和-5）培养48小时后，固定并用碘化丙啶染色。使用ModFif软件（A）通过流式细胞仪分析DNA含量，以获得每个细胞周期阶段的细胞百分比。通过血清饥饿48h，在G0/G1细胞周期阶段同步培养对照细胞和AS1细胞，然后释放到细胞周期中。在指定的时间，将细胞固定，并用流式细胞术（B）分析细胞分裂周期的进展。显示了每个细胞周期阶段的细胞含量（%）。数据表示为三个独立实验的平均值±标准平均误差（SEM）。星号表示显著差异(第页<0.05）。
图3
图3。诺可唑暴露诱导Dp71缺失细胞凋亡。
（A） 对照细胞和Dp71敲除细胞（AS1）的异步培养物在正常条件下（-）或在指定浓度下与诺卡唑培养36小时。然后，将细胞固定并用碘伏染色，以进行流式细胞术分析。AS1细胞中的Sub-G0细胞数量用箭头表示。（B） 诺卡唑处理的对照细胞和AS1细胞用碘化丙啶染色，贴在盖玻片上，并用荧光共聚焦显微镜进行分析。DIC，相间差异对比。合并的图像显示在右侧面板上。白色箭头表示凋亡细胞的膜突起，黄色箭头表示有丝分裂抑制细胞的DNA排列。酒吧 = 10微米。（C） 用抗细胞周期素B1抗体进行western blotting分析从用0.2µg/mL诺可唑处理的对照细胞和Dp71缺失细胞中获得的总蛋白提取物。将膜剥离并用抗肌动蛋白抗体重新处理以进行正常化。蛋白质标记物的迁移如右图所示。未经处理的对照细胞中cycline B1的相对蛋白水平设置为1。结果用三个独立实验的平均值±标准差（SD）表示。星号表示显著差异(第页<0.05). 数据表示为三个独立实验的平均值±标准平均误差（SEM）。
图4
图4。有丝分裂中Dp71和β-dystroglycan在对照细胞和Dp71敲除细胞中的定位。
对照组和Dp71缺失（克隆AS1）细胞用胸腺嘧啶核苷阻滞24 h，并用新鲜培养基在玻璃盖玻片上培养10 h释放。用抗Dp71（+78抗体）、α-微管蛋白（A）或β-肌营养不良聚糖（β-Dg，LG5抗体）和α-微管蛋白（B）抗体对细胞进行双重染色。使用适当的FITC或TRITC结合二级抗体开发特异性蛋白信号。用DAPI（蓝色）对细胞进行复染以显示细胞核。标记后，对细胞制剂进行共焦显微镜分析，并选择单个光学Z截面来显示每个蛋白质的分布。合并的图像显示在右侧面板中。箭头和箭头分别表示有丝分裂纺锤体极中存在Dp71和β-dystroglycan。酒吧 = 5微米。
图5
图5。以Dp71和β-dystroglycan为靶点，在对照组和胞质分裂期的Dp71缺失细胞中分裂沟和中体。
接种在盖玻片上的对照细胞和Dp71反义（AS1）细胞被胸腺嘧啶核苷阻滞在S期24小时，并用新鲜培养基培养10小时后释放。对细胞进行双重染色，检测Dp71（Mandra 1抗体）和肌动蛋白（H-196）（A组）、Dp 71（+78）和α-微管蛋白（B-7）（B组）、β-dystroglycan（β-Dg，DgC20抗体）和肌动蛋白（H-196）（C组），或β-dysroglycan。使用适当的FITC或TRITC结合二级抗体产生特异性信号。用DAPI（蓝色）对细胞进行复染以显示细胞核，并进行共聚焦显微镜分析。选择单个光学Z截面来显示每个蛋白质的分布。合并的图像显示在右侧面板中。箭头指向Dp71或β-dystroglycan与肌动蛋白在卵裂沟处的共同定位（分别显示在面板A和C中），而箭头指向Dp 71或β-dysoglycan和α-微管蛋白在中体处的共定位（分别表示在面板B和D中）。酒吧 = 5微米。
图6
图6。在PC12细胞中，Dp71与层粘连蛋白B1相关，而Dp71缺失细胞显示层粘连肽B1水平降低。
用抗层粘连B1抗体或无关抗体（IgG0）免疫沉淀对照细胞的核提取物。免疫沉淀蛋白用抗层粘连蛋白B1和抗Dp71（H4）抗体（A）进行免疫印迹分析。GST和GST-Dp71融合蛋白在细菌系统中表达，通过细菌裂解物与谷胱甘肽珠培养纯化，并通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色进行可视化。GST和GST-Dp71蛋白固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠上，并与PC12核提取物孵育以进行亲和下拉分析（B）。用SDS-PAGE解析对照细胞和Dp71缺失细胞（AS1、-2和-5克隆）的总细胞提取物，并用抗层粘连B1抗体进行免疫印迹分析。将膜剥离并用抗肌动蛋白抗体重新处理以进行正常化（C）。蛋白质标准的迁移如左图所示。
图7
图7。有丝分裂和胞质分裂时，Dp71缺失细胞中层粘连蛋白B1的免疫标记减少。
在对照和从胸苷诱导的停滞释放8和10小时的Dp71敲低（AS1）细胞中分析层粘连蛋白B1在间期和有丝分裂（A）和胞质分裂（B）期间的分布。用抗层粘连蛋白B1和抗α-微管蛋白抗体对细胞制剂进行双重染色，并用DAPI（蓝色）进行复染，以进行共聚焦显微镜分析。图像的合并显示在右侧面板中。箭头、箭头和星号分别指向有丝分裂纺锤体、重整核和中体的层粘连B1定位。酒吧 = 10微米。
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