Fukutin-related protein resides in the Golgi cisternae of skeletal muscle fibres and forms disulfide-linked homodimers via an N-terminal interaction

doi:10.1371/journal.pone.0022968

.2011;6（8）：e22968。

doi:10.1371/journal.pone.0022968。 Epub 2011年8月23日。

福田相关蛋白存在于骨骼肌纤维的高尔基池中，并通过N末端相互作用形成二硫键同源二聚体

迈松·阿勒哈米迪¹, 伊丽莎白·杰尔德森·布万格（Elisabeth Kjeldsen Buvang）, 托里尔·法格海姆, Vigdis Brox公司, 西格德·林达尔, 玛丽克·范·盖勒, Ø伊凡德·尼尔森

附属公司

PMID： 21886772
预防性维修识别码： PMC3160285型
内政部： 10.1371/日记本.0022968

福田相关蛋白存在于骨骼肌纤维的高尔基池中，并通过N末端相互作用形成二硫键同源二聚体

迈松·阿勒哈米迪等。公共科学图书馆一号. 2011.

.2011;6（8）：e22968。

doi:10.1371/journal.pone.0022968。 Epub 2011年8月23日。

作者

附属

¹挪威特罗姆瑟North-Norway大学医院医学遗传学系儿童和青少年健康科。

PMID： 21886772
预防性维修识别码： PMC3160285型
内政部： 10.1371/日记本.0022968

摘要

肢体带肌营养不良2I型（LGMD2I）是一种遗传性常染色体隐性疾病，由位于19号染色体（19q13.3）上的FuKutin-Related Protein（FKRP）基因突变引起。FKRP突变也与先天性肌营养不良（MDC1C）、沃克-沃伯格综合征（WWS）和肌眼-脑疾病（MEB）有关。这四种疾病的共同点是膜/细胞外基质（ECM）蛋白α-dystroglycan的O-糖基化不完全/异常。然而，对FKRP的结构和生物学功能缺乏进一步的了解，其在细胞内的位置也存在争议。基于人体骨骼肌切片的免疫金电子显微镜，我们证明FKRP与中转高尔基体标记物MG160共同定位于人股直肌肌纤维中的肌原纤维之间。化学交联实验、成对酵母2杂交实验和共同免疫沉淀实验表明，FKRP在细胞培养中表达时可以作为同型二聚体以及大型多聚体蛋白复合物存在。FKRP同源二聚体通过最N-末端半胱氨酸Cys6提供的二硫键桥保持在一起。FKRP含有高甘露糖和/或杂交型N-聚糖；然而，FKRP同二聚体或多聚体的形成不需要FKRP N-糖基化。我们提出了一个FKRP模型，该模型与高尔基体II型跨膜蛋白的模型一致。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。通过双重EM免疫金标记确定骨骼肌中FKRP亚细胞定位。**
用FKRP207和FKRP208一级抗体的混合物检测FKRP，然后用山羊抗兔抗体标记，并与5nm金颗粒（a、B、C和D）结合。亚细胞标记抗体为抗MG160（高尔基体）（A，B）、抗肌膜病（肌膜）（C）和抗PDI（内质网）（D）。检测亚细胞标记蛋白的二级抗体是山羊抗鼠抗体，与10nm金颗粒结合。选定区域（框架）扩大了200%。

**图2。重组FKRP在哺乳动物细胞中形成多聚体。**
用pcDNA3.1-FKRP或空载体（pcDNA3.1）转染COS-7和BHK-21细胞。转染细胞48小时后，用蛋白酶抑制剂溶解在裂解缓冲液中。A）清除的COS-7裂解液未经处理（1道），或在室温下用400 mM DTT还原30分钟（2道），或者在99°C下用样品还原剂还原5分钟（3道和4道），然后进行（4–12%）SDS-PAGE和Western blot分析。通道1-3：pcDNA3.1-FKRP转染的裂解物。通道4：pcDNA3.1转染的裂解物作为阴性对照。B）在室温下用10 mM EGS处理已清除的BHK-21裂解液30 min，并用35 mM Tris（pH 7.5）淬火15 min。用样品还原剂在99°C下还原EGS处理的样品和伴随的未处理对照样品5 min，并进行SDS-PAGE和Western blot分析。在上述实验中，使用FKRP207抗体检测FKRP。MWM是分子量标记。

**图3。配对Y2H分析和CO-IP实验证明FKRP自交互作用。**
A）通过交配获得含有诱饵结构体pB27-FKRP（N-LexA-FKRP32-494-C）和猎物结构体pP7-FKRT（N-GAL4-FKRP32.494-C）的二倍体酵母细胞，并在所示稀释度下，将其定位在缺乏Trp和Leu的非选择性培养基（左侧）和缺乏Trp、Leu和His的选择性培养基上（右侧）。阴性对照组分别含有空诱饵和祈祷载体pB27和pP7，或pB27与pP7与猎物和诱饵构建物组合。阳性对照（C+）包含人类SMAD3作为诱饵（GI:5174512）和人类SMURF1作为猎物（GI:31317291），如材料和方法所述。B）用抗-Myc抗体从COS-7细胞裂解液中沉淀FKRP-Myc融合蛋白。裂解产物通过pcDNA3.1-FKRP-Myc/pcDNA3.1_FKRP-HA联合转染（Cotr）或单独转染pcDNA3.1-FKRP-Myc和pcDNA3.11-FKRP-HA制备。通过混合pcDNA3.1-FKRP-Myc和pcDNA3.1-FKRP-HA裂解产物，然后在室温下培养30分钟（混合），制备额外样品。用于Co-IP的所有细胞裂解物均在5 mM NEM存在下制备。pcDNA3.1和pcDNA3.1-FKRP-HA单独转染细胞的裂解物作为阴性对照，而pcDNA3.3-Myc转染细胞裂解物作为抗Myc免疫沉淀的阳性对照。输入样品和沉淀物在还原条件下进行（4–12%）SDS-PAGE，然后进行Western blot分析。在单独的印迹上，分别用抗Myc和抗HA抗体检测FKRP-Myc和FKRP-HA。为了评估Co-IP实验的严格性，剥离其中一个印迹（抗HA），并用抗MAPK抗体测定内源性MAPK（下图）。

**图4。FKRP二聚体和多聚体的形成不依赖于N-糖基化。**
用pcDNA 3.1-FKRP转染细胞。转染细胞48小时后，用蛋白酶抑制剂溶解在裂解缓冲液中。A）按照材料和方法中的说明，用PNGase F或Endo H处理清除的BHK-21裂解液，并在还原条件下进行（4–12%）SDS-PAGE，然后进行Western blot分析。未经处理的样本作为对照。B）用突变pcDNA3.1-FKRP构建物转染COS-7细胞，其中参与N-糖基化的一个或两个天冬酰胺（Asn）被谷氨酰胺（Gln）取代。在5 mM NEM存在下制备裂解产物，并对其进行非还原性（左侧面板）或还原性SDS-PAGE（330 mM DTT，RT 30 min）（右侧面板），然后进行Western blot分析。在这些实验中，使用抗体FKRP207检测FKRP。

**图5。FKRP同源二聚体的形成依赖于Cys6-Cys6二硫键。**
A）原理图表示FKRP C端子删除构造。FKRP-373、FKRP-282和FKRP-157表示突变结构的长度（aa）。红色竖线表示Cys（C）位置，而黄色竖线表示推测的N-糖基化位点的位置Asn公司-X-Thr/Ser（N-X-T/S）。在以下实验中，用不同的pcDNA3.1构建物转染COS-7细胞，并在转染后48小时在5 mM NEM存在下制备清除的裂解物。在所有这些实验中，用一抗FKRP207检测FKRP。B） FKRP C末端缺失突变体中清除的裂解物要么未经处理，要么进行还原（400 mM DTT，RT 30 min），然后进行（4–12%）SDS-PAGE和Western blot分析。C） FKRP Cys的清除裂解物→Ser取代突变体要么未经处理（左图），要么进行还原（400 mM DTT，在RT下，30分钟）（右图），然后进行（4-12%）SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。单体形式和二聚体形式（5C）之间迁移的差异可能代表SDS-PAGE解析的FKRP构象不同。这种构象差异可能由Cys引起→Ser突变作为一些突变的Cys残基，肯定与分子内二硫键有关。D）将缺失构建体FKRP-157的COS-7裂解产物及其Cys6Ser突变体在非还原条件下进行SDS-PAGE，然后进行Western blot分析。

**图6。高尔基体FKRP二聚体模型的建立；一种假定的糖基转移酶。**
根据II型跨膜糖基转移酶模型，该结构包括一个球形催化结构域、一个干区、一个单通路跨膜结构域和一个细胞质N末端尾部。基于目前的工作，我们认为FKRP通过延伸到干区的相互作用界面形成同二聚体。这种相互作用由N端细胞质尾部的Cys6-Cys6二硫键桥稳定，从而产生具有双重对称性的共价连接FKRP二聚体。催化结构域可能与其他蛋白质相互作用，形成大的多聚体结构（未示出）-S-S-；二硫键，Y；高甘露糖和/或杂交型N-聚糖。

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1. Ervasti JM，Campbell KP。肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物的膜组织。单元格。1991年；66:1121–1131。-公共医学

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