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.2011年10月28日；286(43):37347-57.
doi:10.1074/jbc。M111.235531。 Epub 2011年8月30日。

miR-497和miR-302b通过BCL2蛋白和细胞周期蛋白D2调节乙醇诱导的神经元死亡

桑杰·雅达夫 1, 安基塔·潘迪, 阿鲁娜·舒克拉, Sarang S Talwelkar公司, 阿舒托什·库马尔, Aditya B长裤, 德文德拉·帕玛
附属公司

miR-497和miR-302b通过BCL2蛋白和细胞周期蛋白D2调节乙醇诱导的神经元死亡

桑杰·雅达夫等。 生物化学杂志. .

摘要

在慢性酒精中毒患者中，由于神经元死亡导致的大脑萎缩和认知缺陷已经得到了很好的证实，尽管分子事件的顺序尚未得到充分研究。我们探讨了microRNAs（miRNAs）在乙醇诱导的神经元细胞凋亡中的作用。使用实时PCR-based TaqMan低密度阵列鉴定了人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中的乙醇敏感性miRNAs。长期暴露于乙醇（0.5%v/v，72小时）可使miR-497（474倍）和miR-302b（322倍）的表达量增加最多。与SH-SY5Y类似，长期暴露于乙醇会在另一种人类神经母细胞瘤细胞系IMR-32中诱导miR-497和miR-302b。使用电子方法，BCL2和细胞周期蛋白D2（CCND2）被鉴定为这些miRNAs的可能靶基因。用这些基因的3'-UTR和miRNA模拟物进行的共转染研究表明，BCL2是miR-497的直接靶点，CCND2受miR-302b或miR-497.负调控。miR-497或miR-302b的过度表达降低了其确定的靶基因的表达，并增加了caspase 3介导的SH-SY5Y细胞凋亡。然而，仅miR-497的过度表达增加了活性氧物种的形成，破坏了线粒体膜电位，并诱导了细胞色素c的释放（与线粒体相关的凋亡事件）。此外，乙醇诱导的miRNAs及其靶基因的变化通过预先接触GSK-3B抑制剂而得到了实质性的阻止。总之，我们的研究表明，乙醇诱导的神经元凋亡遵循线粒体介导（miR-497-和BCL2-介导）和非线粒体介导的（miR-302b-和CCND2-介导）途径。

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数字

图1。
图1。
短期（4小时，A类和B)或长期（72小时，C类和D类)乙醇暴露对用NTC siRNA或dicer siRNA转染的SH-SY5Y细胞的活力的影响。细胞活力用MTT测定(A类和C类)和NRU(B和D类)分析。将转染NTC siRNA并暴露于不同浓度乙醇（短期或长期）的细胞的存活率与转染NTC-siRNA且未暴露于乙醇的细胞的生存率进行比较（对照=100%）。同样，将转染dicer siRNA并暴露于乙醇（短期或长期）的细胞的存活率与转染dice siRNA且未暴露于乙醇的细胞的生存率进行比较。所有值均为四个不同实验的平均值误差线表示平均值+S.E。通过单向方差分析和事后Tukey检验计算对照组和不同乙醇暴露组之间的统计显著性。显示的值第页在Tukey测试中<0.05被认为具有统计学意义，并被标记一,b条,c（c）,d日,电子、和（f）.（骰子K（K）D类：骰子击倒(杜兰特)).
图2。
图2。
使用TLDA阵列通过实时PCR在SH-SY5Y细胞中对miRNAs进行全局表达谱分析。 A类，短期暴露后SH-SY5Y细胞miRNA表达的火山图(A类和B)或长期接触(C类和D类)转化为乙醇。图1，A类和C类，表示TLDA板A池中存在的miRNA集合。图1，B和D类，表示TLDA板池B中存在的miRNAs组。对于短期暴露，细胞暴露于2.0%v/v乙醇中4h，对于长期暴露，细胞接触于0.5%v/v酒精中72h。火山图绘制在折叠变化的log2之间与它的第页从学生的t吨测试。这个黑线使用箭头中间表示1的基因表达发生了折叠变化。平行于中心线，两个垂直线两侧各一个，表明基因表达发生了+3倍的变化。这个单条水平线框内指示的阈值第页的值t吨测试，设为0.05。E类，短期接触乙醇后，前五个miRNA发生改变。F类，长期接触乙醇后，前五个miRNA发生改变。未接触乙醇的细胞被视为对照，并用于使用-ΔΔ循环阈值法（对照=1）计算折叠变化。#，对照样品中未扩增MiR-369–3p，因此计算时，其Ct取35（最终循环数）。在条形图，折叠变化由10乘以表示4。所有值均为三个单独实验的平均值。重大变化由学生计算t吨测试*，第页< 0.05.
图3。
图3。
乙醇对IMR-32细胞miR-497和miR-302b的诱导作用(A类)以及这些miRNAs的异位表达对SH-SY5Y细胞凋亡的影响(B和C类)和IMR-32(D类和E类)单元格。 A类对对照组和乙醇暴露（长期暴露，0.5%v/v×72 h）IMR-32细胞中的miR-497和miR-302b进行实时PCR。B通过FITC annexin V染色进行细胞死亡分析的点图，然后对转染NTC、Syn-miR-497或Syn-miR-302b的SH-SY5Y细胞进行流式细胞术分析。C类流式细胞仪分析观察到的SH-SY5Y细胞总死亡的条形图分析。D类用FITC annexin V染色进行细胞死亡分析的点图，然后对转染NTC、Syn-miR-497或Syn-miR-302b的IMR-32细胞进行流式细胞术分析。E类流式细胞仪分析观察到的IMR-32细胞总死亡的条形图分析。在FITC-A和PE-Texas Red之间绘制点图。第一季度，象限I（坏死细胞）；问题2象限2（晚期凋亡细胞）；第3季度象限3（活细胞）；第4季度象限4（早期凋亡细胞）。为了计算总细胞死亡的倍数变化，单独计算并添加早期凋亡、晚期凋亡和坏死的倍数变化。将转染NTC的细胞视为对照，并用于计算转染Syn-miR-497或Syn-miR-302b的细胞的早期凋亡、晚期凋亡或坏死的倍数变化。所有数值都是三个单独实验的平均值。重大变化由学生计算t吨测试*，第页< 0.05.RQ（请求），相对量化。
图4。
图4。
miR-497或miR-302b诱导的caspase 3活性的异位表达(A类)和下调BCL2和/或CCND2的表达(B–D类)通过靶向这些基因的3′-UTR(电子-仪表和E-II型). A类使用荧光底物Ac-DEVD-AMC转染NTC（对照=100%）、Syn-miR-497或Syn-miR-302b的细胞裂解液中测得的caspase 3活性。在380 nm的激发波长和450 nm的发射波长下，使用多壁板阅读器测量荧光。B实时PCR检测miR-497、miR-302b或NTC（对照=1）异位表达对BCL2或CCND2转录水平的影响。将转染Syn-miR-497或Syn-miR-302b的细胞中BCL2和CCND2的表达与转染NTC的细胞中的表达进行比较（对照=1）。C类miR-497、miR-302b或NTC的异位表达对通过免疫印迹法在SH-SY5Y细胞的细胞裂解液中测量的BCL2或CCND2蛋白水平的影响。车道1，NTC；车道2，Syn-miR-497；车道3，Syn-miR-302b。D类BCL2和CCND2免疫印迹的密度测定如所示B.工程pEZX-MT01载体与BCL2的3′-UTR共转染SH-SY5Y细胞的荧光素酶检测(我)或CCND2(二)和miRNA模拟物或NTC（对照=100%）。当细胞转染NTC siRNAs时，使用空的pEZX-MT01载体进行共转染。萤火虫荧光素酶和雷尼利亚荧光素酶活性按照“实验程序”中的描述进行测量，萤火虫荧光素酶活性按照雷尼利亚同一井的荧光素酶活性。所有值均为三个单独实验的平均值。重大变化由学生计算t吨测试*，第页< 0.05.
图5。
图5。
miR-497、miR-302b或NTC（对照）异位表达对ROS形成的影响(A类和B)和MMP损失(C–E类)在SH-SY5Y细胞中。 A类如“实验程序”所述，通过流式细胞术测量转染Syn-miR-497、Syn-miR-302b或NTC（对照）的细胞中ROS的形成。第2页，基础荧光；第3页，增加明亮的荧光。B流式细胞术测定的ROS形成变化%交流，使用JC-1对MMP损失进行流式细胞术分析，JC-1是用Syn-miR-497、Syn-miR-302b或NTC转染的SH-SY5Y细胞中的双发射电位敏感探针（对照）。D类，条形图，表示流式细胞术后观察到的MMP损失百分比C.E公司JC-1孵育细胞的荧光成像，以验证miRNAs异位表达诱导的MMP丢失。1-3，细胞转染NTC。4-6，细胞转染了Syn-miR-497。7-9，细胞转染Syn-miR-302b。所有值均为三个单独实验的平均值。重大变化由学生计算t吨测试*，第页< 0.05.
图6。
图6。
miR-497、miR-302b或NTC（对照）异位表达对SH-SY5Y细胞细胞色素c释放的影响。 A类线粒体部分VDAC-1（线粒体负荷控制）和β-肌动蛋白（细胞溶质负荷控制）水平(Mito-F公司)和细胞溶质部分(细胞-F)转染NTC、Syn-miR-497或Syn-miR-302b的细胞。B对转染NTC、Syn-miR-497或Syn-miR-302b的细胞的Mito-F和Cyto-F中的细胞色素c进行免疫印迹。C类细胞色素c免疫印迹密度测定法计算细胞色素c在线粒体和细胞溶质组分之间的百分比分布。在密度测定后，在NTC-、Syn-miR-497或Syn-miR-302b转染的细胞的线粒体和胞浆部分中检测到的细胞色素c的量被单独添加，并被认为是100%。所有值均为三个单独实验的平均值。重大变化由学生计算t吨测试*，第页< 0.05.
图7。
图7。
预先暴露GSK-3B抑制剂对乙醇诱导SH-SY5Y细胞死亡的影响。 A类，细胞暴露于乙醇(E类，0.5%×72小时），锂(L（左），20米米)+E，TDZD-8(吨, 10 μ米)+E或车辆控制(风险资本). 细胞死亡检测采用FITC膜联蛋白V染色，流式细胞仪分析。数据以点图形式显示（FITC-A与PE-Texas Red对比绘制）。第一季度，象限I（坏死细胞）；问题2象限2（早期凋亡细胞）；第3季度象限2（活细胞）；第4季度，象限4（晚期凋亡细胞）。B，流式细胞术观察到的总细胞死亡的条形图分析A类为了计算总细胞死亡的倍数变化，需要单独计算并添加早期凋亡、晚期凋亡和坏死的倍数变化。与溶媒对照组相比，计算E-、L+E-或T+E-暴露组早期凋亡、晚期凋亡和坏死的倍数变化。通过单向方差分析和两两Tukey检验计算显著变化。显示的值第页Tukey检验中<0.05被认为具有统计学意义。一,第页与车辆控制相比<0.05；b条,第页与乙醇暴露细胞相比，<0.05）。
图8。
图8。
GSK-3B抑制剂预暴露的影响(L（左）、锂或吨，TDZD-8）对乙醇诱导的miR-497、miR-302b、BCL2或CCND2表达的改变。 A–D，miR497的表达(A类)，miR-302b(B)，BCL2(C类)和CCND2(D类)用实时PCR检测GSK-3B抑制剂和乙醇暴露的SH-SY5Y细胞。E类，暴露于GSK-3B抑制剂和乙醇的SH-SY5Y细胞的总细胞裂解物中BCL2、CCND2和β-肌动蛋白的免疫印迹。F类免疫印迹密度测定。用于接触的浓度为乙醇(E类)0.5%×72小时；锂(L（左）)，20米米; 和TDZD-8(吨), 10 μ米。miR-497和miR-302b的表达是通过TaqMan分析测定的，而BCL2和CCND2的表达是根据“实验程序”中提到的SYBR绿色化学测定的。miR-49和miR-302b表达的倍数变化是通过将其在暴露于载体对照的细胞中的水平视为1倍来计算的。通过单向方差分析和两两Tukey检验计算显著变化。一,第页< 0.05与车辆控制；b条,第页< 0.05与乙醇。
图9。
图9。
结果的图片摘要。这个箭头带有● 底部表示两个事件之间的联系。↑ 表示活动或表达增加，以及↓ 表示表达减少。
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