跳到主页面内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2011年11月；31(21):4335-47.
doi:10.1128/MCB.06075-11。 Epub 2011年8月29日。

钙蛋白酶-1裂解Rad21促进姐妹染色单体分离

阿尼尔·K·帕尼格拉希 1, 张能刚, 骑龙毛, 黛巴南达·帕蒂
附属公司

钙蛋白酶-1裂解Rad21促进姐妹染色单体分离

阿尼尔·K·帕尼格拉希等。 分子细胞生物学. 2011年11月.

摘要

定义染色体内聚和染色单体内聚蛋白复合体溶解的机制对于理解许多肿瘤细胞中的染色体错位很重要。在这里，我们报道了一种新的粘蛋白溶解蛋白酶的鉴定，并描述了其在染色体分离中的作用。姐妹染色单体由凝集素结合在一起，凝集素是一种由Rad21、Smc1、Smc3和SA2（或SA1）组成的多蛋白环状复合物。众所周知，内聚蛋白通过两种不同的机制从脊椎动物染色体上去除，即前期和后期途径。首先，PLK1介导的SA2在前期磷酸化导致粘蛋白从染色体臂释放，留下着丝粒粘蛋白，继续将姐妹连接在一起。然后，在后期开始时，激活的分离酶裂解着丝粒凝集素Rad21，从而打开凝集素环并允许姐妹染色单体分离。我们在此报道钙依赖性半胱氨酸内肽酶钙蛋白酶-1是一种Rad21肽酶，通常定位于间期细胞核和染色质。钙蛋白酶-1以钙依赖的方式在L192处裂解Rad21。我们进一步表明，钙蛋白酶-1对Rad21的切割促进了染色体臂的分离，这与钙诱导的多个染色体位点的部分凝集素丢失相一致。在钙蛋白酶可清除位点进行Rad21的工程切割而不激活钙蛋白酶-1可能导致姐妹染色单体内聚力的丧失。总之，我们的工作揭示了钙蛋白酶-1的新功能，并描述了人类姐妹染色单体分离的额外途径。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
Rad21是钙蛋白酶-1的底物。（A） Myc公司。使用小麦胚芽提取物体外合成的Rad21与0、0.2、0.5、1.25和1.25 mU纯化钙蛋白酶-1（分别为1到5道）孵育；将ALLN以5μM最终浓度添加到最后的反应混合物中（通道5）。全长（FL）和解理（Cl.）Rad21带由箭头指示。（B） 用CaCl处理Molt4细胞2（最终浓度为2 mM），持续5 h（车道2）或用5μM ALLN进行额外预处理（车道3）。用所示抗体检测WCE。（C） （顶部）hRad21示意图和钙蛋白酶-1解理位点的相对位置（未按比例绘制）。倒箭头表示裂变键。（底部）Rad21序列相对于人类蛋白质序列（氨基酸[aa]168至202）的系统发育序列比较。凝胶左边的数字表示以kDa为单位的分子量。
图2。
图2。
钙蛋白酶-1对Rad21的裂解。（A） WT和突变Rad21中钙蛋白酶可清除位点侧翼的氨基酸序列（相对于aa 184至202）。替换残基和TEV裂解序列分别以斜体和粗体突出显示。（B） WT和突变Myc。体外合成Rad21蛋白并与1 mU钙蛋白酶-1孵育。非特定带标有星号。（C） WT和电子电视突变型Myc。Rad21蛋白与或不与0.5 U TEV蛋白酶（TEV）孵育。（D） 用空载体（EV）或携带WT或WT的质粒转染HEK293T细胞德尔突变型Myc。内源性Rad21被靶向hRad21 3′-UTR的siRNA双链体敲除。转染后2天，用10 mM CaCl处理细胞2持续6 h（E）用对照或钙蛋白酶-1特异性siRNA（双链A）转染HEK293T细胞，并用10 mM CaCl处理2转染后第3天持续6小时。
图3。
图3。
钙诱导的Rad21裂解与凋亡或坏死无关。（A） 在添加CaCl之前，用足叶乙甙（Etop；最终浓度20μM）或ALLN（最终浓度5μM）预处理Molt4细胞30分钟2（2 mM最终浓度）。6小时后收集细胞，制备WCE。请注意，钙诱导的Rad21裂解产物（Cl.Rad21）与凋亡裂解产物（Apopt.Cl.Rad二十一）不同。非特定带标有星号。（B） 用2 mM CaCl处理Molt4细胞2或5μM足叶乙甙28 h，用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色，并用光镜和荧光显微镜观察。右边的图表显示了凋亡细胞的数量占细胞总数的百分比。
图4。
图4。
钙蛋白酶-1定位于染色质并裂解染色质结合的Rad21。（A） 细胞分离方案。在添加CaCl之前，用ALLN（最终浓度，5μM）预处理细胞30分钟2（2 mM）持续10 h。（B）用所示抗体对核提取物（Nuc.Extr.）和染色质部分进行解析和探测。（C） 钙处理后Rad21裂解的分级。Jurkat细胞，在存在或不存在2 mM CaCl的情况下处理2在指定的时间（小时）内，将其分为胞质提取物（CE）、核提取物（NE）和染色质（Chr）组分。用免疫印迹法分析等体积比例的蛋白质。显示全长（FL）和裂解（Cl.）Rad21蛋白。α-管蛋白、层粘连蛋白B和组蛋白H3可作为细胞分离的标记物。（D） 使用Triton X-100提取之前（顶部）和之后（底部）使用指示抗体对HeLa细胞进行免疫荧光染色。
图5。
图5。
Calpain-1激活会影响Rad21占用率。（A） Jurkat细胞中Rad21和钙蛋白酶-1的染色质占有率。显示了9个粘蛋白结合位点和3个无粘蛋白位点（CFS）的Rad21和calpain-1占用率。（B） Myc-tagged WT和德尔转染对照（顶部）或钙蛋白酶-1（双链A）（底部）siRNA的HEK293T细胞中的突变Rad21。平均阈值周期(C类T型)分析三个独立生物重复（每次重复三次）的每个引物对的值。误差条表示平均值的标准误差。
图6。
图6。
钙蛋白酶-1影响姐妹染色单体分离。（A） 中期的四种主要类型被考虑在内。（B） 用2 mM CaCl处理Jurkat细胞2持续2天和4天，然后与未经处理的对照组一起进行蛋白质分析（顶部）和中期扩散分析（底部）。对各种中期类型进行评分。（C） 用对照（Ctr）siRNA双链体和靶向Rad21、separase（Sep）和calpain-1（Calp1；双链A）的siRNA转染HEK293T细胞。在转染后72小时收集细胞。显示了蛋白质（顶部）和中期扩散（底部）分析。（D） 用对照和钙蛋白酶-1（双链A）siRNA转染HeLa细胞，并用10 mM CaCl处理2转染后2天。通过免疫印迹分析细胞的蛋白质谱（左）和通过FACS分析细胞的DNA含量（右）。（E） HEK293T细胞转染三种独立的钙蛋白酶-1 siRNA之一（双工A、B和C）或对照siRNA，并用CaCl处理2转染后48小时。蛋白质图谱（顶部）和中期染色体分析（底部）如图所示。非特定带标有星号。
图7。
图7。
（A） 双胸苷阻滞后HeLa细胞同步和释放示意图。（B） HeLa细胞通过双胸苷阻滞同步，在第一次胸苷阻断后用钙蛋白酶-1 siRNA双链A转染，最后在添加或不添加10mM CaCl的情况下释放8小时2显示了蛋白质剖面（全细胞裂解物）（顶部）和FACS分析的细胞百分比（底部）。组蛋白H3显示为加载控制。1号和2号通道代表在G区被捕的牢房1/S过渡。（C） 双胸苷块释放后8小时收集的细胞的中期扩散分析。将单个10-cm平板上的细胞平均分裂，并进行蛋白质、FACS和中期扩散分析。
图8。
图8。
首先用WT-Myc质粒转染HEK293T细胞。Rad21（WT）或Myc。半径21电子电视（tev）和pCS2MT-tev（pTEV），如图所示。20小时后，用靶向Rad21的3′-UTR的siRNA双工体转染细胞。细胞在收获前再生长48小时。显示了蛋白质谱（A）和中期扩散（B）分析。
图9。
图9。
钙蛋白酶-1介导的Rad21裂解和姐妹染色单体分离模型。钙蛋白酶-1（CAPN1）对粘连蛋白手铐中一个或两个Rad21分子（以白色切口表示）的裂解同样会导致姐妹染色单体内聚力的丧失，也可以缓解姐妹染色单体中的粘连蛋白介导的连锁反应。钙蛋白酶-1对凝集素的切割可能是分离姐妹的另一种机制，有助于Plk1介导的前期途径。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Beckouet F.等人，2010年。Smc3乙酰化循环对于姐妹染色单体凝聚力的建立至关重要。分子细胞39:689–699-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Birkenbihl R.P.，Subramani S.1992年。波贝裂殖酵母参与DNA双链断裂修复的关键基因rad21的克隆与鉴定。核酸研究20:6605–6611-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bootman M.D.、Fearnley C.、Smyrnias I.、MacDonald F.、Roderick H.L.，2009年。核钙信号的更新。细胞科学杂志。122:2337–2350-公共医学
    1. Bootman M.D.、Young K.W.、Young J.M.、Moreton R.B.、Berridge M.J.，1996年。细胞外钙浓度控制细胞内钙尖峰的频率，独立于HeLa细胞中肌醇1，4，5-三磷酸的产生。生物化学。期刊314:347-354-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Borges V.等人，2010年。Hos1使Smc3脱乙酰化，以关闭内聚素乙酰化循环。分子细胞39:677–688-公共医学

出版物类型

MeSH术语