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.2011年10月14日；286(41):35456-35465.

doi:10.1074/jbc。M111.236794。 Epub 2011年8月23日。

组蛋白3赖氨酸9（H3K9）甲基转移酶向白细胞介素2（IL-2）启动子募集是转化生长因子-β-Smad途径抑制IL-2转录的机制

附属公司

附属公司

¹庆应义塾大学医学院微生物与免疫学系，35 Shinanomachi，Shinjuku-ku，Tokyo 160-8582，Japan。
²日本福冈九州大学医学研究生院，邮编812-8582。
^三庆应义塾大学医学院微生物学和免疫学系，35 Shinanomachi，Shinjuku ku ku，Tokyo 160-8582，Japan and Japan Science and Technology Agency，CREST，Chiyoda ku，Tokyo 102-0075，Japan。电子地址：yoshimura@a6.keio.jp。

PMID： 21862595
预防性维修识别码：项目经理3195630
内政部： 10.1074/jbc。M111.236794号

组蛋白3赖氨酸9（H3K9）甲基转移酶向白细胞介素2（IL-2）启动子募集是转化生长因子-β-Smad途径抑制IL-2转录的机制

于瓦卡巴亚什等。生物化学杂志. 2011.

.2011年10月14日；286(41):35456-35465.

doi:10.1074/jbc。M111.236794美元。 Epub 2011年8月23日。

附属公司

¹庆应义塾大学医学院微生物与免疫学系，35 Shinanomachi，Shinjuku-ku，Tokyo 160-8582，Japan。
²日本福冈九州大学医学研究生院，邮编812-8582。
^三庆应义塾大学医学院微生物学和免疫学系，35 Shinanomachi，Shinjuku ku ku，Tokyo 160-8582，Japan and Japan Science and Technology Agency，CREST，Chiyoda ku，Tokyo 102-0075，Japan。电子地址：yoshimura@a6.keio.jp。

PMID： 21862595
预防性维修识别码：项目经理3195630
内政部： 10.1074/jbc。M111.236794号

摘要

抑制T细胞产生IL-2β是TGF-β免疫调节的重要过程。然而，这种抑制发生的机制尚待确定。在这里，我们证明了两种主要的TGF-β下游转录因子Smad2和Smad3对于使用Smad2-和Smad3-缺陷T细胞的TGF--β介导的CD4（+）T细胞中IL-2生成的抑制至关重要。Smad2和Smad3均被招募到IL-2启动子的近端区域，以响应TGF-β。然后我们研究了IL-2启动子的组蛋白甲基化状态。虽然组蛋白H3赖氨酸9（H3K9）和H3K27三甲基化都与基因沉默有关，但在IL-2启动子的近端区域，只有H3K9-三甲基化以Smad2/3依赖的方式增加，而H3K27-三甲基化没有增加。H3K9甲基转移酶Setdb1和Suv39h1结合到Smad3并与Smad3协同抑制IL-2启动子活性。无论TGF-β的存在与否，在68-41 T细胞中Suv39h1的过度表达都强烈抑制了T细胞受体刺激时IL-2的产生，而Setdb1过度表达仅轻微抑制了IL-2的生成。shRNA沉默Suv39h1可逆转TGF-β对IL-2生成的抑制作用。此外，TGF-β诱导Suv39h1募集到野生型原代T细胞IL-2启动子的近端区域；然而，在Smad2（-/-）Smad3（+/-）T细胞中没有观察到这种情况。因此，我们提出Smads将H3K9甲基转移酶Suv39h1募集到IL-2启动子，从而诱导抑制性组蛋白甲基化并抑制T细胞受体介导的IL-2转录。

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数字

图1。 — 图1。
Smad2和Smad3对TGF-β介导的IL-2抑制具有多余的必要性。 A类，幼稚的CD4⁺在TGF-β存在或不存在的情况下，用抗CD3和抗CD28抗体刺激WT小鼠的细胞，并用实时RT-PCR测定IL-2和Foxp3的mRNA水平。B类，幼稚的CD4⁺来自LckCreSmad2的单元格^{飞行/飞行}（Smad2^−/−)、Smad3^−/−，或LckCre-Smad2^{飞行/飞行}Smad3公司^+/负极（Smad2^−/−Smad3公司^+/负极)在存在（+）或不存在（-）TGF-β的情况下，用抗CD3和抗CD28刺激小鼠24小时。从T细胞中分离出mRNA，并进行微阵列分析。显示了与TGF-β（−）相比，TGF-α（+）中Foxp3和IL-2 mRNA的正常水平。C类，FACS分类的原始CD4⁺用抗CD3和抗CD28在不同浓度下刺激T细胞，包括或不包括TGF-β1。第3天，用PMA和离子霉素重新刺激细胞5小时。在重新刺激开始后不到1小时，将布雷费尔丁A添加到培养物中。通过细胞内染色评估细胞产生IL-2。所示数据代表三个独立实验，一式三份，结果相似。

图2。 — 图2。
Smad3被招募到IL-2启动子近端区域，在那里它抑制IL-2启动因子活性。 A类，幼稚T细胞（7×10⁶)在存在或不存在TGF-β的情况下，用抗CD3和抗CD28抗体（TCR）刺激24小时，然后使用抗Smad2和Smad3特异性抗体进行ChIP分析。通过实时PCR扩增并量化IL-2启动子DNA的远端（−8.3至−8.1）和近端（−0.4至−0.3）。数值为平均值+S.D(n个= 3) *,第页< 0.05.B类NF-AT激活IL-2启动子，Smad3抑制。将IL-2启动子5′-非编码区的指示长度与荧光素酶融合，并与NF-AT和Smad3 cDNA（1μg）一起转染293细胞。用PMA刺激转染的细胞并测量荧光素酶活性。**，第页< 0.01.C类、核酸序列和推测的转录因子结合位点。显示了CAGA图案。D类，−194启动子中CAGA基序突变对Smad3介导的启动子抑制的影响。用所示报告人、NF-AT和Smad3转染293细胞，然后测量荧光素酶活性。**，第页< 0.01.

图3。 — 图3。
Smads的DNA结合对于IL-2启动子的抑制不是必需的。 A类将−194 IL-2启动子与NF-AT和Smad2或Smad3 cDNA质粒一起转染293细胞。用PMA刺激后，测量荧光素酶活性。数值为平均值+S.D(n个= 3). **,第页< 0.01.B类Smad3 DNA结合区突变对IL-2启动子抑制的影响。左侧将WT或R74A突变型Smad3 cDNA和SBE-荧光素酶转染293细胞。48小时后，测量荧光素酶活性。赖特将−194 IL-2启动子报告子与每个突变体和NF-AT共同转染。通过免疫印迹法和抗FLAG抗体测定Smad3蛋白的表达水平(下部面板). **,第页< 0.01.

图4。 — 图4。
原代T细胞中IL-2启动子区的组蛋白修饰对TCR和TGF-β刺激的反应。 A类H3K9、H3K27和H3K4在WT和Smad2-或Smad3-缺乏小鼠刺激的初级T细胞中的三甲基化，通过ChIP分析进行评估。初级CD4⁺在存在或不存在TGF-β的情况下，用抗CD3和抗CD28抗体（TCR）刺激指定小鼠的T细胞24小时。IL-2启动子近端区域（第一个ATG密码子上游-0.3至-0.4 kb）的组蛋白三甲基化（H3K9me3、H3K27me3和H3K4me2）使用所示抗体通过ChIP分析检测。ND（无损检测），未确定。数值为平均值+S.D(n个= 3). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01.B类通过ChIP分析分析IL-2启动子处H3（H3K9me3）的K9三甲基化。在存在或不存在TGF-β的情况下，用抗CD3抗体刺激原代T细胞24小时。上面板显示用抗H3K9me3抗体免疫沉淀后扩增的区域。**，第页< 0.01.

图5。 — 图5。
组蛋白甲基转移酶与Smad3相互作用，增强IL-2启动子抑制活性。 A类，293细胞用−194 IL-2启动子报告子NF-AT和少量Smad3（0.1μg）以及指示的HMT cDNA（1μg）转染。用PMA刺激后，测量荧光素酶活性。数值为平均值+S.D(n个= 3). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01.B类，Smad3与HMT的结合。将所示质粒转染293细胞，然后进行裂解。用抗FLAG抗体免疫沉淀后，用Western blotting分析共沉淀蛋白(工作分解结构)使用指示的抗体。C类Setdb1和Suv39h1过度表达的影响。68-41个T细胞被携带GFP、Smad3、Setdb1和Suv39h1的逆转录病毒感染。然后将受感染的细胞分选为GFP阳性细胞进行纯化。在存在或不存在TGF-β的情况下，用抗CD3抗体（TCR）刺激细胞24小时，并通过定量RT-PCR测定IL-2 mRNA。**，第页< 0.01.D类、天真的WT或Smad2^−/−Smad3公司^+/负极T细胞（7×10⁶)在存在或不存在TGF-β的情况下用TCR刺激24小时，然后使用抗Suv39h1抗体进行ChIP分析。通过实时PCR扩增并量化IL-2启动子DNA的远端（−8.3至−8.1）和近端（−0.4至−0.3）区域(n个= 3). *,第页< 0.05.

图6。 — 图6。
敲除Suv39h1对TGF-β介导的IL-2抑制的影响。 A类，68-41 T细胞被携带GFP或shSuv39h1-1和shSuv39 h1-2 DNA的逆转录病毒感染。然后用FACS将感染细胞纯化为GFP阳性细胞。提取总RNA，并通过实时RT-PCR测定Suv39h1 mRNA的水平(左侧面板). 电池（5×10⁵)然后在有或无TGF-β（1.0 ng/ml）的情况下用抗CD3抗体（TCR）刺激12 h，并通过定量RT-PCR测定IL-2 mRNA(中间面板). 在每次感染中，有TGF-β存在时的IL-2 mRNA水平与无TGF-(右侧面板). 数值为平均值+S.D(n个= 3). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01.B类，幼稚T细胞（1×10⁶)用抗CD3和抗CD28抗体刺激WT小鼠24 h，然后再进行病毒感染24 h，用FACS分离GFP阳性细胞（～50%），然后用RT-PCR测定Suv39h1 mRNA水平(左边). 电池（2×10⁵)在存在或不存在TGF-β（0.5 ng/ml）的情况下，用抗CD3抗体重新刺激12 h。通过实时RT-PCR测定IL-2 mRNA水平(正确的)用ELISA法测定培养物中IL-2蛋白水平(C类). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01.

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