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.2011年10月；31(19):4107-18.
doi:10.1128/MCB.05546-11。 Epub 2011年8月1日。

人类CABIN1是人类HIRA/UBN1/ASF1a组蛋白H3.3伴侣复合物的功能成员

Taranjit Singh Rai公司 1, 阿萨塔·普里, 托尼·麦克布莱恩, 霍夫曼, 永唐, 尼古拉·普切林塞夫（Nikolay A Pchelintsev）, 约翰·范·图恩, 罗恩·马尔莫斯坦, 大卫·C·舒尔茨, 彼得·亚当斯
附属公司

人类CABIN1是人类HIRA/UBN1/ASF1a组蛋白H3.3伴侣复合物的功能成员

Taranjit Singh Rai公司等。 分子细胞生物学. 2011年10月.

摘要

哺乳动物HIRA/UBN1/ASF1a复合体是一种组蛋白伴侣复合体，从酵母（酿酒酵母）保存到人类。这种复合物以DNA复制无关的方式优先将组蛋白变体H3.3沉积到染色质中，并与从基因激活到异染色质化的各种染色质调节事件有关。在酵母中，同源复合物由三种Hir蛋白（Hir1p、Hir2p和Hir3p）、Hpc2p和Asf1p组成。酵母Hir3p与人类复合体的第四个成员CABIN1具有弱同源性，表明Hir3p和CABIN1可能是同源基因。在这里，我们显示HIRA和CABIN1在细胞内异位和内源性表达水平上相互作用，并且我们分离出由重组蛋白组装的四元HIRA/UBN1/CABIN1/ASF1a（HUCA）复合物。突变分析支持HIRA作为支架将UBN1、ASF1a和CABIN1组合成四元复合体的观点。我们表明，与HIRA、UBN1和ASF1a一样，CABIN1参与衰老人类细胞基因组的异染色质化。此外，在增殖细胞中，HIRA和CABIN1调节重叠的基因集，这些基因富含组蛋白变体H3.3。总之，这些数据表明CABIN1是人类HUCA复合体的功能成员，也是酵母Hir3p的可能同源物。

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数字

图1。
图1。
HIRA、UBN1和CABIN1的物理相互作用。（A） CABIN1和酿酒酵母Hir3p的比对示意图显示了保守的N末端TPR。（B） 通过与抗HA抗体共免疫沉淀（IP）检测外源性表达的HA-HIRA和myc-CABIN1相互作用。（C） siRNA介导的内源性HIRA和CABIN1的敲除证实了HIRA和CABIN1抗体的特异性。（D） siRNA介导的内源性CABIN1的敲除通过免疫荧光证实了CABIN1抗体的特异性。（E） 通过与HIRA抗体（WC15和D32）和CABIN1抗体（ab3349）共免疫沉淀检测骨肉瘤细胞（U2OS）和原代成纤维细胞（IMR90）中内源性HIRA和CABIN1的相互作用。分别使用抗鼠IgG（Anti-myc 9E10；Santa Cruz）和抗兔Ig G（M7023；Sigma）作为小鼠和兔抗体的对照IgG。（F） 内源性UBN1和CABIN1的相互作用，通过与CABIN1抗体（ab3349）共免疫沉淀检测。
图2。
图2。
HIRA上CABIN1交互域的映射。（A） 用所示质粒瞬时转染U2OS细胞，并用抗HA免疫沉淀（IP）。车道1，模拟；车道2，野生型HA-HIRA和野生型myc-CABIN1；泳道3，仅野生型HA-HIRA；泳道4，仅野生型myc-CABIN1；泳道5至8，野生型myc-CABIN1和指示的HA-HIRA突变体[泳道5，HA-HIRA（del 439-475）；泳道6，HA-HIRA（del 520-1017）；泳道7，HA-HIRA（421-729）；泳道8，HA-HIRA（1-600）]。示意图的颜色编码如下：黄色条，WD40重复；红色条，B域；蓝色方框，C域。抗体。（B） 用所示质粒瞬时转染U2OS细胞，并用抗HA免疫沉淀。车道1，模拟；车道2、野生型myc-CABIN1和野生型HA-HIRA；3号车道，野生型myc-CABIN1和HA-HIRA（del737-963）；车道4，野生型myc-ASF1a和野生型HA-HIRA；车道5，野生型myc-ASF1a和HA-HIRA（del737-963）。示意图的颜色编码如图A所示。（C）昆虫Sf9细胞被编码所示蛋白的杆状病毒感染，并通过反标记亲和层析纯化复合物。所示为重组蛋白的考马斯蓝（R250）染色。通道对应于以下蛋白质：1，flag-UBN1；2、国旗-UBN1和他的——HIRA；3，国旗-UBN1，他的——HIRA和GST-ASF1a；4，旗-UBN1，他的——HIRA、GST-ASF1a和myc-CABIN1；5，国旗-UBN1，他的——HIRA和myc-CABIN1；6、标志-UBN1、HIRA（1-405）和myc-CABIN1。（D） 使用面板C的输入裂解物（IN）、柱流通（FT）和洗脱物（E）的指示抗体进行Western blot分析。
图3。
图3。
CABIN1上HIRA交互域的映射。（A） 用所示质粒瞬时转染U2OS细胞，并用抗myc免疫沉淀。车道1、野生型myc-CABIN1和野生型HA-HIRA；车道2，野生型myc-CABIN1；3号车道，野生型HA-HIRA；车道4，myc-CABIN1（1-941）和野生型HA-HIRA；车道5，myc-CABIN1（942-2220）和野生型HA-HIRA；车道6，myc-CABIN1（401-2220）和野生型HA-HIRA。（B） 用编码His-HIRA、GST-UBN1（1-175）和Flag-ASF1a的杆状病毒感染昆虫Sf9细胞，通过镍亲和层析纯化重组复合物。图中显示的是重组蛋白的考马斯蓝（R250）染色。（C） 来自具有指示抗体的组B的复合物的蛋白质印迹。（D） 如图所示，将来自B组的三聚蛋白复合物与来自用野生型myc-CABIN1、myc-CABIN1（1-941）或myc-CABIN1（1-400）转染的U2OS细胞的裂解物孵育。如图所示，结合蛋白被免疫印迹。（E） 基于本文报道的结合研究和先前发表的文献的HUCA复合体示意图。
图4。
图4。
CABIN1调节衰老。（A） 对PD30和PD88 IMR90成纤维细胞进行衰老标记物、SAβ-Gal和SAHF染色。（B） 对A组细胞表达SAβ-Gal、cyclin A、SAHF、HIRA病灶和CABIN1病灶的细胞百分比进行评分。数值为三个独立实验的平均值（SEM）的平均值±标准误差。（C） A组的细胞用HIRA、PML小体和CABIN1抗体染色，用DAPI染色以显示SAHF。（D） 沿着穿过CABIN1/PML焦点的直线，DAPI、PML体和CABIN1荧光的相对强度。（E） Western blot显示IMR90细胞中致癌H-RasG12V的表达。（F） H-RasG12V表达细胞经PML小体抗体CABIN1和DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）染色。（G） 用pLXSN或pLXSN-myc-CABIN1感染IMR90细胞，用所示抗体对裂解产物进行蛋白质印迹。（H） 对G组的细胞进行SAβ-Gal、cyclin A、HIRA病灶和SAHF评分。数值为三个独立实验的平均值±SEM。（一） G组细胞染色检测SAβ-Gal，DAPI检测SAHF。
图5。
图5。
HIRA和CABIN1调节重叠的基因集。（A） 如图所示，用siRNAs对HeLa细胞进行HIRA、CABIN1或非靶向（NTG）对照的核感染。用Smartpool siRNAs对HIRA或CABIN1进行三次独立的核感染。对裂解液进行Western blot检测HIRA、CABIN1和β-actin，如图所示。（B） 饼图显示HIRA或CABIN1击倒后探针显著上调和下调。绿色表示上调探头，红色表示下调探头。（C） qRT-PCR分析以确认siHIRA敲除后微阵列检测到的表达变化。折叠变化是通过将siHIRA细胞中的归一化（到看家基因）表达除以siNTG细胞中的规范化（到看家基因）表示来计算的。*，P（P）> 0.05.P（P）其余9个基因均<0.05。数值为四个独立实验的平均值±SEM。（D） 表中显示了HIRA和CABIN1击倒后更换探针的重叠。（E） 热图显示了在三次独立的siHIRA或siCABIN1基因敲除后表达发生变化的基因的层次聚类，与三次独立siNTG核感染相比。绿色表示上调探头，红色表示下调探头。（F） 将来自HeLa细胞的超声染色质与GFP或HIRA抗体进行免疫沉淀，并通过qPCR检测所指示的靶基因。在HIRA敲低时，HPD和MALL的表达增加，而所有其他的表达减少。从倍数变化（FC）>1.2倍的基因列表中随机选择基因P（P）<0.05来自siHIRA敲除细胞。数值为三个独立ChIP实验的平均值±SEM。P（P）所有比较均<0.05。
图6。
图6。
HIRA激活的基因富含组蛋白H3.3。（A） 热图显示HIRA或CABIN1敲除后相对于siNTG的折叠变化排序的基因H3.3富集，以及两个独立敲除后相对siNTG平均折叠变化。上年轴，基因按折叠变化排序；上x个轴，沿着基因的位置显示在从基因上游5kb到转录起始位点（TSS）的1-kb窗口中，以及从基因下游5kb的转录终止位点（TES）的1kb窗口。在基因体中，使用了基因长度5%的窗口。（B） 组蛋白H3.3在三类基因上的平均富集，根据它们对HIRA敲除的反应来定义。x个轴，沿着基因在1-kb窗口中的位置，从基因上游5kb到转录起始位点（TSS），以及从TES到基因下游5kb的1-kb窗。在基因体中，使用了基因长度5%的窗口。（C） 组蛋白H3.3在三类基因上的平均富集，根据它们对CABIN1敲除的反应来定义。结果的颜色编码如面板B所示。（D）组蛋白H3.3在三类基因上的平均富集，根据它们对HIRA和CABIN1敲除的平均反应来定义。结果的颜色编码如面板B所示。
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