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.2011年11月；51（5）:803-11。
doi:10.1016/j.yjmcc.2011.06.026。 Epub 2011年7月21日。

内皮-心肌细胞串扰增强药物性心脏保护

托尔斯滕·M·莱克 1, 马丁·比恩格拉伯, 玛丽亚·穆拉维耶娃, Ines Baotic公司, 多萝西·维赫劳赫, 安娜·布热津斯卡, 大卫·C·沃提耶, 朱迪·克尔斯滕, 菲利普·普拉特
附属公司

内皮-心肌细胞串扰增强药物性心脏保护

托尔斯滕·M·莱克等。 J Mol Cell心脏病学. 2011年11月.

摘要

内皮细胞（EC）具有旁分泌功能以增强心肌细胞（CM）的信号传导，相反，CM分泌影响EC功能的因子。了解EC如何与CM相互作用对于缺血再灌注损伤至关重要，EC可能会促进CM存活。我们使用异氟烷作为药物刺激来增强CM对缺氧和复氧损伤的EC保护。细胞内信号转导途径的触发最终导致一氧化氮（NO）的生成增加，这似乎是药物诱导心脏保护的核心组成部分。虽然内皮被公认为血管张力的调节器，但其在介导心脏保护方面的潜在重要性却很少受到关注。在当前的研究中，采用共培养的EC-CM来验证以下假设：EC有助于异氟烷增强CM对缺氧和复氧损伤的保护，并且这种保护依赖于缺氧诱导因子（HIF1α）和NO。CM对细胞损伤有保护作用[乳酸脱氢酶（LDH）释放]在有无异氟醚刺激EC的情况下，这种保护作用更大（LDH释放变化1.7±0.2倍vs.4.58±0.8倍），并且这种保护作用是NO-依赖性的。异氟醚增强EC中NO的释放（1103±58 vs.702±92 pmol/mg蛋白质），而EC-CM在复氧过程中持续释放NO。相反，慢病毒介导的EC中HIF1α基因敲除以eNOS依赖性方式降低了基础和异氟醚刺激的NO释放（517±32 vs.493±38 pmol/mg蛋白），并阻止了共同培养时复氧期间NO的持续增加。线粒体通透性转换孔（mPTP）是线粒体完整性的一个指标，在有EC和无EC的情况下，其开放延迟（141±2 vs.128±2.5任意mPTP开放时间）。在正常氧张力下，异氟醚刺激EC中的HIF1α增加，但CM中HIF1α没有增加（3.5±0.1倍对0.79±0.15倍变化密度），这种作用通过使用有丝分裂原激活蛋白/细胞外信号调节激酶抑制剂U0126预处理而被阻断。Western blot和免疫荧光证实HIF1α的表达和核转位。综上所述，这些数据支持异氟醚刺激EC产生重要的心脏保护因子的概念，这些因子可能有助于在缺血和再灌注损伤期间保护心肌。

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数字

图1
图1
（A） 实验协议示意图。在有或无异氟醚（ISO）的情况下，缺氧-复氧对细胞存活的影响，通过共同培养（CM+EC）中的乳酸脱氢酶（LDH）活性测定。（B） 添加N的影响G公司-硝基-我-精氨酸甲酯(我-NAME）在实验方案的不同时间点。
图2
图2
（A） 代表性蛋白质印迹显示低氧诱导因子（HIF1α）在异氟醚处理的内皮细胞（EC）中的时间表达。HIF1α蛋白量表示为对照组的倍数变化。（B） 异氟醚（ISO）处理的心肌细胞（CM）和EC中HIF1α的表达。HIF1α蛋白量表示为相应未处理对照（CON）的倍数变化。数据为平均值±SEM（n=6/组）*与基线相比P<0.05，ISO暴露30或120分钟，†与CON EC相比，P<0.05。
图3
图3
（A） 免疫荧光描绘了缺氧诱导因子（HIF1α）在异氟醚存在和不存在的情况下，并用丝裂原活化蛋白/细胞外信号调节激酶抑制剂UO126预处理的内皮细胞（EC）中的表达和亚细胞定位（绿色=HIF1α，蓝色=DAPI核染色）。（B） 具有代表性的Western blot研究显示细胞溶质和核HIF1α蛋白在EC中的表达，包括异氟醚（ISO）和UO126（ISO+UO126）。HIF1α蛋白量表示为相应未处理对照（CON）的倍数变化。数据为平均值±SEM（n=6/组）*与胞质CON相比P<0.05，**与胞质ISO相比P<0.05，§与核CON相比P<0.05，†与核ISO相比，P<0.05。
图4
图4
（A） 直方图描述了在异氟烷存在（H/R+ISO）或不存在（H/R）的情况下，经历缺氧-复氧（H/R）或常氧的心肌细胞（CM）和内皮细胞（EC）的乳酸脱氢酶（LDH）活性。小组（B）总结了H/R在异氟烷存在（ISO）或不存在（CON）的情况下，在添加或不添加NG-硝基的情况下对共培养（CM+EC）的影响-我-精氨酸甲酯(我-名称）。LDH活性表示为各正常毒性组的倍数变化。数据为平均值±SEM（n=8/组）*与相应的正常氧相比，P<0.05，†与CON相比P<0.05，‡与ISO相比，P<0.05。
图5
图5
描述缺氧（A组）和复氧（B组）期间异氟醚存在（ISO）或不存在（CON）时内皮细胞（EC）、心肌细胞（CM）和共培养物（EC和CM共同培养；CC）中一氧化氮（NO）生成的直方图。NO-每毫克蛋白质的pmol水平，表示为与基线相比减少或增加的百分比。数据为平均值±SEM（n=6/组）*P<0.05 vs.CON EC（缺氧），**P<0.05 vs.ISO EC（低氧），†与CON共培养（缺氧）相比P<0.05，‡与ISO EC（缺氧）相比P<0.05，§与CON EC（复氧）相比P<0.05，#与ISO EC（复氧）相比，P<0.05。
图6
图6
（A） 通过异氟烷（ISO）刺激的心肌细胞（CM+ISO）和共培养（EC和CM一起培养；CC+ISO）中四甲基罗丹明乙酯（TMRE）荧光的快速消散，观察到光激发产生的氧化应激诱导线粒体通透性转换孔（mPTP）开放。（B） TMRE荧光强度在初始和剩余荧光强度之间减少一半的时间被视为“任意mPTP开放时间”（箭头），并在实验组之间进行比较（a.u.=任意单位）。面板（C）显示了表示任意mPTP打开时间的直方图。CysA=环孢素A（n=8/组）。数据为平均值±SEM*与CM相比P<0.05，#与CM+ISO相比P<0.05，§与CC相比，P<0.05。
图7
图7
小组（A）代表性的Western blot描绘了未感染EC（CON）中的HIF1α蛋白，EC带有带干扰序列的慢病毒载体（SCR），EC感染含有HIF1αshRNA的慢病毒。HIF1α免疫反应带在CON上表现为折叠变化（n=6/组）。小组（B）总结了乳酸脱氢酶（LDH）在与未感染内皮细胞（EC，对照）共培养（CM+EC）中的活性，EC感染表达干扰shRNA的慢病毒（干扰shRNA），EC感染缺氧诱导因子的shRNA慢病毒（HIF1αshRNA）。在存在或不存在异氟醚（ISO）的情况下，共培养物受到缺氧和复氧（H/R）。LDH活性表示为正常毒性组（n=6/组）的倍数变化。小组（C）代表性的Western blot显示eNOS和磷酸化eNOS在未感染EC中的表达，带有慢病毒载体的EC携带扰码序列（SCR），EC存在NG公司-硝基-我-精氨酸甲酯(我-NAME）和EC感染含有HIF1αshRNA的慢病毒（shRNA），在有或无ISO的情况下接受H/R（n=6/组）。数据为平均值±SEM*与正常氧相比P＜0.05，†与H/R（对照）相比P<0.05，‡与H/R（加扰shRNA）相比P<0.05，§与H/R+ISO（加扰shRNA）相比P<0.05，#与CON相比P<0.05，与SCR相比P<0.05，&与各自对照组（CON）相比P<0.05，$与EC CON相比P<0.05，¢与EC（SCR）CON相比，P<0.05，¥与EC ISO相比P<0.05，£与EC（SCR）ISO相比，P<0.05。
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