Nitric oxide-associated protein 1 (NOA1) is necessary for oxygen-dependent regulation of mitochondrial respiratory complexes

doi:10.1074/jbc.M111.221986

.2011年9月16日；286(37):32086-93.

doi:10.1074/jbc。M111.221986。 Epub 2011年7月19日。

一氧化氮相关蛋白1（NOA1）对线粒体呼吸复合物的氧依赖性调节是必要的

朱莉安娜·海德勒¹, 娜塔莉·阿尔福鲁克, 克里斯蒂安·库卡特, 伊莎贝尔·萨维格, 玛丽·伊丽莎白·英格尔曼, 塞贝尔, 马库斯·克鲁格, 吉尔根·霍尔茨, 伊尔卡·维蒂格, 托马斯·布劳恩, 马丁·斯齐博尔

附属公司

PMID： 21771794
预防性维修识别码：项目经理1173199
内政部： 10.1074/jbc。M111.221986号

一氧化氮相关蛋白1（NOA1）对线粒体呼吸复合物的氧依赖性调节是必要的

朱莉安娜·海德勒等。生物化学杂志. 2011.

.2011年9月16日；286(37):32086-93.

doi:10.1074/jbc。M111.221986。 Epub 2011年7月19日。

作者

朱莉安娜·海德勒¹, 娜塔莉·阿尔·福鲁克, 克里斯蒂安·库卡特, 伊莎贝尔·萨维格, 玛丽·伊丽莎白·英格尔曼, 塞贝尔, 马库斯·克鲁格, 吉尔根·霍尔茨, 伊尔卡·维蒂格, 托马斯·布劳恩, 马丁·斯齐博尔

附属

¹马克斯·普朗克心肺研究所心脏发育和重塑系，德国巴德瑙海姆，路德维希大街43号，61231号。

PMID： 21771794
预防性维修识别码：项目经理1173199
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摘要

在真核细胞中，细胞ATP储存的维持主要依赖于线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），而这反过来又需要足够的细胞氧合。适当的氧合对细胞生存能力的关键作用体现在多种机制的参与上，这些机制根据可用氧浓度感知缺氧并调节呼吸复合体的活动。在这里，我们将重点放在小鼠一氧化氮相关蛋白1（mNOA1）上，该蛋白已被确定为调节氧合酶活性以达到氧浓度的机制的重要组成部分。mNOA1是一种进化保守的GTP结合蛋白，参与线粒体蛋白翻译和呼吸的调节。我们发现mNOA1主要位于线粒体基质中，在那里它与几个高分子量复合物相互作用，最显著的是与呼吸链的复合物IV和禁令复合物。mNOA1的敲除损害了酶活性I+III，导致氧化应激，最终导致细胞死亡。mNOA1以氧敏感的方式转录调节。我们认为mNOA1的氧依赖性调节有助于调节氧合酶活性以获得氧气，从而控制线粒体代谢。

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数字

**图1。**
**mNOA1位于线粒体内膜内。** A类显示了mNOA1荧光融合蛋白与线粒体染料的共定位。mNOA1与线粒体基质标记物（Mito-EGFP）共定位，但与大线粒体外膜标记物（EGFP-OMP25-Fr）或内膜标记物不共定位。使用的细胞系为HeLa、NIH 3T3和143B。TK-K7。这个*比例尺*，10微米。B类mNOA1-mCherry在HeLa中的线粒体基质定位以及缬氨酸霉素诱导的大线粒体。外膜用EGFP-OMP25-Fr染色。注意，基质由未融合的内膜分隔（标记为箭头). 这个*白色条*表示2.5μm。

**图2。**
**mNOA1与高分子量络合物共迁移，形成二聚体或多聚体。** A类和B类用蔗糖梯度离心法分离可溶性全心线粒体(A类)或通过BN-PAGE(B类). 在变性和还原条件下，通过Western blotting分析蔗糖梯度组分和分离的呼吸链复合物。在变性但非还原条件下制备BN-PAGE分离的复合物，以检测mNOA1二聚体或多聚体。C类C2C12成肌细胞与编码mNOA1-FLAG和mNOA1-EGFP的载体共转染。针对mNOA1的FLAG-IP和Western blot分析显示了三条带，而针对GFP的分析显示了一条带。这些单体蛋白带指示mNOA1二聚体或多聚体的形成。

**图3。**
**mNOA1调节C2C12成肌细胞的线粒体酶活性。** A类，过表达时复合物I和I+III的酶活性(*运行经验*)野生型mNOA1、K353R P回路变体或瞬态mNOA1击倒(*kd（分子量）*)归一化为线粒体标记酶柠檬酸合成酶，并以百分比表示。B类，使用JC-1瞬时敲除mNOA1后的线粒体膜电位。数据表示JC-1聚集体与单体的比率。C类mNOA1短暂敲除或过度表达后的细胞ATP水平。数据以平均值±S.D.表示(*误差线*).

**图4。**
**mNOA1击倒(克朗)降低线粒体重超复合物和复合物IV的稳定性。** A类显示了使用Total OxPhos Complex试剂盒在BN-PAGE上分离的洋地黄素固体转染细胞的Western blot分析。B类，为了估计超复合体的蛋白质质量，使用了复合体IV、III和V的已知分子质量以及相应的迁移距离。+，用于校准的蛋白质复合物；●, 分析了超复合体。根据Wittig描述的计算分子质量得出的超复合体组成等。(47).C类，对呼吸复合物水平进行了定量分析。数据以平均值±S.D.表示(*误差线*).

**图5。**
**mNOA1击倒(*kd（分子量）*)导致C2C12成肌细胞线粒体氧化应激。** A类，使用MitoSOX红的线粒体产生的超氧物的FACS直方图。B类，硫氧还蛋白-2的代表性蛋白质印迹作为氧化应激的敏感标记归一化为VDAC/porin.H₂O（运行）₂-处理后的样品作为阳性对照。

**图6。**
**mNOA1击倒(克朗)激活C2C12成肌细胞的线粒体凋亡途径。** A类，细胞色素*c（c）*mNOA1击倒后释放。VDAC/porin用作加载控制。B类mNOA1、caspase-3和PARP的代表性Western blots作为凋亡途径激活的标记物。Pan-actin用作装载控制。C类，mNOA1在1μ米CsA或10米米 N个-乙酰半胱氨酸(*NAC公司*)24小时内，数据为平均值±S.D(*误差线*).天Western blot分析复合物IV的亚单位IV以及复合物I的亚单位30k和75k。VDAC/孔蛋白作为负荷控制。

**图7。**
**mNOA1的表达受氧浓度的调节。** A类在常氧、缺氧6小时或12小时或缺氧24小时和复氧2小时后，C2C12成肌细胞中mNOA1 mRNA表达水平归一化为β-actin(*雷奥克斯*.).B类C2C12成肌细胞在缺氧6小时或12小时后，或缺氧24小时和复氧2小时后，mNOA1蛋白水平恢复为泛素水平。C类C2C12成肌细胞在缺氧12小时或24小时后，或缺氧24小时和复氧2小时后，线粒体酶活性I+III归一化为线粒体标记酶柠檬酸合成酶。数据以平均值±S.D.表示(*误差线*).

**图8。**
**mNOA1在线粒体呼吸控制中的作用模型。**mNOA1在转录水平上的表达受氧的控制。NOA1与呼吸链复合体IV相互作用。通过络合物IV的稳定化，它有助于形成或稳定呼吸超络合物。氧化应激是最小的。mNOA1的缺失会破坏复合体IV和超复合体的稳定性。氧化应激增加。

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