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.2011年7月13日；31(28):10249-61.
doi:10.1523/JNEUROSCI.1917-11.2011。

Parkin与Ambra1相互作用诱导有丝分裂

辛迪·范·汉贝克 1, 汤姆·科内利森, 希尔德·霍夫肯斯, Wim Mandemakers公司, 克里斯·盖沃特, 巴特·德·斯特罗珀, 维姆·范登伯格
附属公司

Parkin与Ambra1相互作用诱导有丝分裂

辛迪·范·汉贝克等人。 神经科学. .

摘要

Parkin编码基因的突变是隐性帕金森病的主要原因。最近的研究表明，Parkin从细胞质转运到去极化线粒体，并诱导其自噬清除（线粒体吞噬）。然而，Parkin介导的有丝分裂的分子机制尚不清楚。在这里，我们研究了Parkin是否与自噬调节蛋白相互作用。我们使用串联亲和纯化法从HEK293细胞中纯化Parkin和相关蛋白，并使用质谱鉴定Parkin相互作用物。我们确定自噬促进蛋白Ambra1（Beclin-1调节自噬的激活分子）是Parkin相互作用物。Ambra1通过刺激III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）复合体的活性激活CNS中的自噬，该复合体对新吞噬细胞的形成至关重要。我们发现Ambra1和Parkin一样在成年小鼠大脑中广泛表达，包括中脑多巴胺能神经元。内源性Parkin和Ambra1共免疫沉淀自HEK293细胞、SH-SY5Y细胞和成年小鼠大脑。我们没有发现Parkin对Ambra1泛素化的证据。在线粒体去极化延长期间，内源性Parkin和Ambra1的相互作用强烈增加。Parkin易位到去极化线粒体不需要Ambra1，但对随后的线粒体清除至关重要。特别是，Ambra1被招募到去极化线粒体的核周簇中，并在其附近激活III类PI3K。这些数据确定Parkin与Ambra1的相互作用是诱导Parkin介导的有丝分裂最后清除步骤的关键机制。

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数字

图1。
图1。
帕金与Ambra1绑定。A类，TAP流程图。B类，无标记和TAP-tagged Parkin.RING，RING finger域示意图；IBR，中间环域。C类，在TAP期间浓缩TAP标记的Parkin。用未标记或TAP标记Parkin转染的HEK293细胞提取物进行TAP处理。提取物，初始细胞提取物；FT，流通；El，洗脱液。用SDS-PAGE和抗Parkin蛋白的Western blot分析连续组分。将等量的总蛋白（0.2μg）加载到每个组分的凝胶上。D类，共4000厘米2用未标记或TAP标记的Parkin转染HEK293细胞培养物，并对提取物进行TAP处理。通过SDS-PAGE和Western blot分析最终TAP洗脱液，并用抗帕金或考马斯蓝染色。1、无标签停车场；2、空车道；3、TAP标签停车场；星号，Parkin带；箭头，Ambra1-包含谱带，由质谱测定。E类,F类，本研究中用于WB的抗Ambra1抗体（战略诊断）的对照实验。E类用空载体或FLAG标记的Ambra1（20 ng/cm）瞬时转染HEK293细胞2cDNA）。蛋白质提取物用SDS-PAGE和WB进行分析，用抗Ambra1或抗FLAG。Anti-Ambra1识别内源性Ambra1并转染Ambra1，而Anti-FLAG仅检测转染的Ambra1。F类HEK293细胞未转染（未转染）或转染对照（Ctrl.）siRNA，安布罗1siRNA 1，或安布拉1小干扰RNA 2。转染后24小时，用所示抗体进行SDS-PAGE和WB。观察到内源性抗Ambra1带在安布拉1siRNA 1或2转染证实了该抗体的特异性。G公司在HEK293细胞中转染TAP-tagged与未标记Parkin，然后转染TAP、TAP洗脱液的SDS-PAGE和WB与抗Ambra1或抗β-actin。H（H）,我，未转染HEK293细胞提取物(H（H）)或成年小鼠大脑(我)用抗-Ambra1或对照IgG进行免疫沉淀（IP），然后用所示抗体对输入和IP级分进行WB。早老素1英寸H（H）和钙调素我显示为阴性对照。J型,K（K），未转染HEK293细胞提取物(J型)或老鼠大脑(K（K）)用抗Parkin或对照IgG进行IP，然后输入WB和带有指示抗体的IP组分。L（左），本研究中使用的Parkin缺失结构。所有删除结构都有一个N端FLAG标记。M（M），HEK293细胞与未标记的全长Ambra1和每个标记的FLAG Parkin缺失结构共同转染。细胞提取物经过IP和抗Ambra1处理，然后进行输入WB和IP部分处理，其中IP部分带有指示的抗体。L、 链接器域。N个，本研究中使用的Ambra1缺失结构。所有构造都有一个C端Myc–FLAG标记。WD40、WD40重复包含域。O（运行）用未标记Parkin共同转染的HEK293细胞的提取物和每个指示的FLAG-标记Ambra1缺失构建物进行IP和抗Parkin，然后对输入和IP部分进行WB和指示抗体。
图2。
图2。
Ambra1的解剖、细胞和亚细胞分布。A类用SDS-PAGE和Western blot对2个月龄小鼠脑区的提取物和所示抗体进行分析。网格。，中脑；Cbl.，第页。，小脑；泰尔。，丘脑；引人注目。，纹状体；奥尔夫。，嗅球。B类,C类，本研究中用于免疫细胞化学的抗Ambra1抗体（Covalab）的对照实验。B类用FLAG标记的Ambra1瞬时转染HEK293细胞，并用抗Ambra1和抗FLAG双重标记。请注意，HEK293细胞中的内源性Ambra1低于该抗Ambra1抗体的免疫细胞化学检测阈值。C类，未转染SH-SY5Y细胞（未转染）或转染对照（Ctrl.）siRNA，安布拉1siRNA 1，或安布拉1siRNA2。转染后24小时，用Ambra1抗体对细胞进行免疫染色。注意，内源性Ambra1在该神经细胞系中可检测到。观察到内源性抗Ambra1信号在安布拉1siRNA 1或2转染证实了该抗体的特异性。D–H型，胚胎期(D类,E类,G公司,H（H）)或出生后(F类)第6天的中脑培养在体外用抗Ambra1和抗MAP2（一种神经元标记物）双重标记(D类)，抗酪氨酸羟化酶（TH），多巴胺能神经元的标记物(E类,F类)，抗GFAP，一种星形胶质细胞标志物(G公司)或抗CNPase，少突胶质细胞标记物(H（H）). 箭头输入D类表示非神经元（MAP2阴性）细胞。显微镜设置G公司和H（H）与中使用的相同D–F型因此，可以将神经胶质细胞中Ambra1染色的强度与神经元中Ambra染色的强度进行比较。我，胚胎中脑培养物用抗Ambra1和抗Parkin双重标记，揭示了神经元胞浆中内源性蛋白的部分共定位。J–N公司，胚胎中脑培养物被抗Ambra1和抗细胞色素双重标记c（c），线粒体标记(J型)，抗KDEL，ER标记(K（K）)，抗GM130，高尔基标记(L（左）)，抗LC3，一种自噬体标记(M（M）)或抗LAMP-1，溶酶体标记(N个). 细胞核用DAPI或TOTO-3染色。比例尺，10μm。
图3。
图3。
Parkin并不是Ambra1的泛素。HeLa细胞(A类,B类)或HEK293电池(C类)如图所示，用HA-标记泛素（HA-Ub）、FLAG-标记IKKγ、Parkin和Ambra1的各种组合转染。转染后24小时，在变性条件下制备提取物。在非变性缓冲液中稀释后，用抗FLAG、抗Ambra1或对照IgG进行免疫沉淀（IP）。IP和输入样本通过SDS-PAGE和Western blot进行解析，抗体显示在blot右侧。在B类，显示了相同的抗HA印迹的短时间和更长时间的膜暴露。
图4。
图4。
线粒体去极化促进内源性Parkin和Ambra1的相互作用。A类,B类，未转染的HEK293细胞(A类)或未转染的SH-SY5Y细胞(B类)用CCCP（10μ米在里面A类; 25 μ米在里面B类)或二甲基亚砜静置12小时，然后用抗Ambra1或对照IgG免疫沉淀细胞提取物。通过SDS-PAGE和Western blot用所示抗体解析输入和IP样本。C类，将SH-SY5Y细胞的提取物分为胞浆（C）和富含线粒体（M）的部分。将相同总量的蛋白质加载到每个组分的凝胶上后，对线粒体标记Tom20和细胞溶质标记GAPDH进行SDS-PAGE和免疫印迹。D类用DMSO或CCCP（25μ米)接下来，将细胞提取物分为细胞溶质和线粒体部分，如C类然后对DMSO和CCCP处理的组分的相同总蛋白量进行抗Ambra1免疫沉淀，然后对抗Parkin免疫沉淀进行WB。
图5。
图5。
Parkin易位到去极化线粒体不需要Ambra1。A类,B类转染Parkin后24小时，用DMSO、CCCP（10μ米)或缬氨霉素（1μ米)3小时后，对Parkin和Tom20进行免疫染色，这是一种线粒体标记物。B类，Parkin与线粒体强共定位的Parkin表达细胞百分比的量化(n个=DMSO为6；n个CCCP和缬氨酸霉素为3）*第页与DMSO相比<0.001。C类，在与Parkin和Ambra1共转染后24小时，用DMSO或CCCP（10μ米)3小时，对Parkin、Ambra1和Tom20进行免疫染色。D类用DMSO或CCCP（25μ米)3小时，对Parkin和Tom20进行免疫染色。箭头输入D类显示与线粒体共定位的Parkin免疫反应簇。E类,F类HeLa细胞未经转染（无转染）或转染对照siRNA，安布拉1siRNA 1，或安布拉1小干扰RNA 2。转染后24小时，用所示抗体进行SDS-PAGE和Western blot。F类，对siRNA处理后的Ambra1蛋白水平进行定量，并将其标准化为对照siRNA转染后的水平(n个= 4). *第页与对照siRNA相比<0.001。G公司,H（H）用Parkin和指示的siRNA共同转染HeLa细胞。24小时后，用CCCP（10μ米)并对Parkin和Tom20进行免疫染色。H（H），Parkin与线粒体强共定位的表达Parkin的HeLa细胞百分比的量化(n个=3）。我,J型，SH-SY5Y细胞转染了指示的siRNA。24小时后，用CCCP（25μ米)免疫染色检测内源性Parkin和Tom20。箭头输入我显示与线粒体共定位的Parkin免疫反应簇。J型、帕金簇与线粒体共定位的SH-SY5Y细胞百分比的量化(n个= 3). 比例尺，10μm。
图6。
图6。
线粒体去极化诱导帕金依赖性的有丝分裂。A类,B类转染Parkin后24小时，用DMSO、CCCP（10μ米)或缬氨霉素（1μ米)24小时，对Parkin和Tom20进行免疫染色。B类、用CCCP或DMSO治疗24小时后未检测到Tom20免疫反应的Parkin阳性和Parkin阴性细胞的百分比(n个=11（对于DMSO）；n个=CCCP为8；n个=3（缬氨霉素）。#第页与CCCP处理的Parkin阴性细胞相比<0.001*第页与DMSO处理的Parkin阳性细胞相比<0.001。§第页与缬氨酸霉素处理的Parkin阴性细胞相比<0.001。C类,D类转染Parkin后24小时，用DMSO或CCCP（10μ米)24小时，并对Parkin和细胞色素进行免疫染色c（c）.D类未检测到细胞色素的Parkin阳性细胞和Parkin阴性细胞的百分比c（c）CCCP或DMSO治疗24小时后的免疫反应(n个= 3). *第页与CCCP处理的Parkin阴性细胞相比<0.001。#第页与DMSO处理的Parkin阳性细胞相比<0.001。E类,F类转染Parkin后24小时，用DMSO或CCCP（10μ米)24小时，并对Parkin和DNA聚合酶γ（POLG）进行免疫染色。F类、用CCCP或DMSO治疗24小时后未检测到POLG免疫反应的Parkin阳性和Parkin阴性细胞的百分比(n个= 3). *第页与CCCP处理的Parkin阴性细胞相比<0.001。#第页与DMSO处理的Parkin阳性细胞相比，<0.001。箭头在A类,C类，以及E类表示Parkin阳性细胞，箭头表示Parkin-阴性细胞。G公司转染Parkin后24小时，用CCCP（10μ米)单独使用CCCP（10μ米)和巴非霉素A1（100 n米)，或使用CCCP（10μ米)和3-甲基腺嘌呤（3MA；10 m米)并对Parkin和Tom20进行免疫染色。定量未检测到Tom20免疫反应的Parkin阳性细胞和Parkin阴性细胞的百分比(n个= 3). *第页与仅用CCCP处理的Parkin阳性细胞相比<0.001。H（H），在用Parkin转染后24小时，用CCCP（10μ米)24小时，对Parkin和过氧化物酶体标记物Pex14p进行免疫染色。我用DMSO或CCCP（25μ米)24小时，Tom20免疫染色。J型,K（K），未转染的SH-SY5Y细胞用DMSO处理24小时，CCCP（25μ米)，或使用CCCP（25μ米)和巴菲尔霉素A1（巴菲尔姆；100 n米). 用SDS-PAGE和Western blot分析细胞提取物和所示抗体。K（K），COX IV的量被量化并标准化为DMSO条件下的COX IV量(n个=DMSO和CCCP为7；n个CCCP=4+巴非霉素A1）*第页与DMSO相比<0.005。#第页与CCCP+巴非霉素A1相比<0.001。比例尺，10μm。
图7。
图7。
Ambra1有助于Parkin介导的有丝分裂。A类,B类，HeLa细胞与Parkin和指示的siRNA共转染，用CCCP（10μ米)为Parkin和Tom20染色。箭头在A类表示Parkin阳性细胞，箭头表示Parkin-阴性细胞。B类，量化siRNA-介导的Ambra1下调对CCCP诱导Parkin阳性细胞有丝分裂的影响(n个= 6–9). *第页CCCP后与对照siRNA条件相比<0.001。C类,D类，SH-SY5Y细胞转染所示的siRNA，用CCCP（25μ米)并为Tom20染色。显微镜设置C类对于不同的siRNA条件是相同的。箭头在C类表示没有检测到线粒体染色的细胞。D类，量化siRNA-介导的Ambra1下调对CCCP诱导的SH-SY5Y细胞线粒体清除的影响(n个= 3). *第页CCCP后与对照siRNA条件相比<0.05。E类在单独转染Ambra1后24小时，用DMSO或CCCP（10μ米)24小时，然后对Ambra1和Tom20进行免疫染色。箭头在E类表明Ambra1-过度表达细胞。F类在与Myc-tagged Ambra1和Parkin共转染24小时后，用DMSO或CCCP（10μ米)24小时，并对Myc、Parkin和Tom20进行免疫染色。箭头在F类表示同时过表达Ambra1和Parkin的细胞，箭头表示仅过表达Parkin的细胞。G公司如图所示，用Myc-tagged Ambra1、Parkin和空载体（EV）的各种组合转染HeLa细胞。转染后24小时，用CCCP（10μ米)在对Myc、Parkin和Tom20进行免疫染色后24小时，对没有线粒体染色的转染细胞百分比进行量化(n个= 3–5). *第页与仅转染EV的细胞相比，<0.001。#第页与转染Parkin和EV的细胞相比，<0.001。比例尺，10μm。
图8。
图8。
去极化线粒体簇周围III类PI3K的激活。A类在转染p40（phox）PX–EGFP后24 h，用75 n处理HeLa细胞1 h米PI3K抑制剂沃特曼或二甲基亚砜。B类用p40（phox）PX–EGFP和Parkin共转染HeLa细胞。转染后24小时，用DMSO或CCCP（10μ米)16小时，对Parkin和Tom20进行免疫染色。最下面一行是上面一行中方框区域的放大。C类，用p40（phox）PX–EGFP转染SH-SY5Y细胞。24小时后，用DMSO或CCCP（25μ米)16小时，Tom20免疫染色。D类，中所示实验的量化B类带有核周线粒体簇的HeLa细胞数量被量化为含线粒体细胞总数的百分比（黑条；n个= 3). 此外，核周线粒体簇与p40（phox）PX–EGFP热点接触的细胞数量被量化为含线粒体细胞总数的百分比（白色条；n个= 3). *第页与DMSO处理的Parkin阳性细胞相比<0.001。#第页与CCCP处理的Parkin阴性细胞相比<0.001。比例尺，10μm。
图9。
图9。
Ambra1以Parkin依赖的方式被招募到去极化线粒体的核周簇。A类在单独转染Ambra1（第1、3行）或与Ambra1和Parkin联合转染（第2、4、5行）后24小时，用DMSO或CCCP（10μ米)16小时，对Parkin、Tom20和Ambra1进行免疫染色。最下面一行是上面一行中方框区域的放大。B类用DMSO或CCCP（25μ米)16h，细胞色素免疫染色c（c）和Ambra1。最下面一行是上面一行中方框区域的放大。比例尺，10μm。
图10。
图10。
Ambra1局部激活去极化线粒体核周簇周围的III类PI3K。A类用Parkin、p40（phox）PX–EGFP和指示的siRNA共同转染HeLa细胞。转染后24 h，用CCCP（10μg）处理细胞16 h米)为Parkin和Tom20染色。B类，中所示实验的量化A类带有核周线粒体簇的Parkin阳性细胞数量被量化为含线粒体Parkin阴性细胞总数的百分比（黑色条；n个= 3). 此外，核周线粒体簇与p40（phox）PX–EGFP热点接触的Parkin阳性细胞数量被量化为含线粒体Parkin阳细胞总数的百分比（白色条；n个= 3). *第页=0.001，与对照siRNA处理的细胞相比。比例尺，10μm。
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