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。2011;6（5）：e19786。
doi:10.1371/journal.pone.0019786。 Epub 2011年5月17日。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制阻止细胞死亡，增强有丝分裂，但不能促进T细胞淋巴瘤

Sih-han Wang（王锡汉） 1, 肖恩·马丁, 彼得·哈里斯, C迈克尔·克努森
附属公司

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制阻止细胞死亡，增强有丝分裂，但不能促进T细胞淋巴瘤

Sih-han Wang（王锡汉）等。 公共科学图书馆一号。 2011。

摘要

Caspase-9是凋亡小体的一个组成部分，在线粒体释放细胞色素c后介导细胞死亡。抑制带有显性阴性结构（Casp9DN）的Caspase-9可阻断凋亡小体功能，促进生存能力，并与致癌有关。体外抑制凋亡小体会损害线粒体功能并促进有丝分裂。为了检测抑制凋亡小体是否会增强体内的有丝分裂并促进肿瘤发生，我们制备了在T细胞系中表达Casp9DN的转基因小鼠。检测Casp9DN对胸腺细胞活力、有丝分裂和胸腺肿瘤形成的影响。在初级胸腺细胞中，Casp9DN延缓了地塞米松（Dex）诱导的细胞死亡，改变了线粒体结构，并减少了氧化剂的生成。透射电镜（TEM）显示，凋亡小体的抑制导致线粒体结构异常，在某些情况下，线粒体被类似于自噬小体的双层膜结构吞噬。与线粒体被自噬体吞噬（线粒体吞噬）相一致，共聚焦显微镜显示LC3-GFP和线粒体共定位。然而，Casp9DN单独或与Lck-Bax38/1或Beclin 1+/-小鼠联合使用均未显著加速T细胞淋巴瘤的发生，线粒体功能改变与促进肿瘤发展有关的两种肿瘤易感菌株。此外，Beclin 1杂合性破坏对Lck-Bax38/1小鼠T细胞淋巴瘤的形成没有影响。进一步研究表明，Beclin 1水平对Casp9DNA诱导的线粒体功能丧失没有影响。这些结果表明，凋亡小体功能的抑制和Beclin 1单倍体不足都不会加速小鼠T细胞淋巴瘤的发展。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。Casp9DN表达抑制Dex诱导的原代胸腺细胞凋亡。
A类)如“实验程序”所述，从野生型（WT）或Lck-Caspase-9DN（Lck-Csp9DN）转基因小鼠的原代胸腺细胞制备全细胞裂解物。显示了前天冬氨酸蛋白酶-9（pro-C9）和肌动蛋白作为负荷控制的免疫印迹。B)从所示基因型的小鼠中分离出初级胸腺细胞，并用或不用Dex（1µM）处理6 h。显示Caspase-3（C3）、PARP和肌动蛋白的免疫印迹，作为负荷对照。C类)用Dex（1μM）处理所示基因型小鼠的分离胸腺细胞。采用泛半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Q-VD-OPh（50μM）作为半胱氨酸蛋白酶抑制的阳性对照。用番石榴流式细胞仪和Viacount试剂测定细胞活力。显示了至少重复样品的平均值±SD。
图2
图2。Casp9DN的表达对Lck-Bax38/1小鼠的胸腺细胞和增殖没有影响。
A类)对8至10周龄的指定基因型小鼠新鲜分离的胸腺细胞进行DNA含量分析。每个符号对应于单个小鼠观察到的循环细胞百分比（%S/G2/M）。显示了每组至少6只小鼠的平均值±SD。B)显示了8至10周龄的所示基因型小鼠的胸腺总细胞数。每个符号对应于单个小鼠观察到的存活胸腺细胞总数。显示了每组至少6只小鼠的平均值±SD。
图3
图3。Casp9DN降低初级胸腺细胞中的ROS水平。
A类)显示了DHE染色活胸腺细胞的代表性直方图叠加。所有细胞均按指示使用或不使用Dex。Caspase活性被Casp9DN表达（红线，Casp9DN）或Q-VD-OPh处理（蓝线，WT+QVD）抑制，并与对照细胞（灰色阴影，WT-wild型胸腺细胞）进行比较。对于直方图叠加图，胸腺细胞的活性如下：；24小时无Dex培养：46%（WT）、56%（Casp9DN）和69%（WT+QVD）；用1μM Dex:7.5%（WT）、20%（Casp9DN）和42%（WT+QVD）培养24小时。底部面板显示了所示样本中DHE染色较低的细胞百分比的定量（直方图中显示了门）。显示每组至少重复小鼠的平均值+SD。§与对照组相比p<0.05。*与对照组相比p<0.01。B） 如图所示，MitoSOX红染色活胸腺细胞的代表性直方图叠加。数据代表了至少3种独立的动物。C） 图中显示了野生型小鼠（灰色阴影，WT）和Lck-Casp9DN小鼠（红线，C9DN）活的新鲜分离胸腺细胞的DHE染色的代表性直方图重叠。这些数字是每个样本在指定门内找到的单元格的百分比。显示了所示基因型小鼠新鲜分离胸腺细胞中%DHE-Low群体的定量。显示了每组至少4只小鼠的平均+SD。*p<0.005。
图4
图4。半胱氨酸天冬氨酸酶抑制增加异常线粒体并激活有丝分裂。
A类)TEM图像显示，在指定的治疗后，来自指定基因型小鼠的分离胸腺细胞的线粒体结构发生了形态学变化（正常线粒体用黑色箭头标记，异常线粒体用黄色箭头标记）。其中一个有丝分裂的例子显示，在右下角的图像中，线粒体簇被双膜自噬体吞噬。四幅图像的放大倍数相同。比例尺 = 0.2微米。N个 = 核心。B)定量每活细胞正常和异常线粒体的平均数量（左侧面板），以及在指定基因型小鼠的分离胸腺细胞中，在指定的治疗4小时后，具有至少1个正常线粒体或至少1个异常线粒体的细胞的百分比（右侧面板）。C类)在不同的Dex治疗时间后，定量从所示基因型小鼠分离的胸腺细胞中含有至少1个异常线粒体的细胞百分比。表中显示，经过各种处理后，未在WT胸腺细胞中观察到异常线粒体。在用Dex处理24小时的WT胸腺细胞中，5%的细胞是活的，因此未显示此样本（@）。用0小时Q-VD-OPh处理的WT胸腺细胞不可用（NA）。D类)在FL5-Neo细胞中，定量每个活细胞正常和异常线粒体的平均数量（左侧面板），以及在24小时的指示治疗后，至少有一个正常线粒体或至少有一种异常线粒体的活细胞的百分比（右侧面板）。E类)转染LC3-GFP（绿色）的FL5-Neo细胞在指定处理48小时后，用MitoTracker Red（红色，MR）对线粒体进行染色，用TO-PRO-3探针（蓝色）对细胞核进行反染色。FL5细胞的存活率：97%（+IL-3）、9%（-IL-3）和66%（-IL-3+QVD）。MR和LC3-GFP染色显示有丝分裂激活。F类)在48小时IL-3剥夺和BafA（20 nM）处理后，用p62（绿色）、MR（红色）检测线粒体，用TO-PRO-3探针（蓝色）检测核反染，对显示表达的FL5细胞进行免疫染色。Pearson相关系数（PCC，R（R））在统计上测量p62和MR的共定位，显示在每个图像中。显示了处理过的FL5细胞的PCC定量。每个符号对应于所示细胞系中每个活细胞的PCC。显示了每次治疗中每个细胞系至少22个细胞的平均±SD。**p<0.0001。
图5
图5。在Lck-Bax38/1转基因小鼠中，Casp9DN的表达并不促进淋巴瘤的形成。
无淋巴瘤生存率的Kaplan-Meier分析A类)比较野生型（黑色方形，N = 8） 和Lck-Casp9DN（绿色实心三角形，N = 12） 老鼠，和B)比较Lck-Bax38/1（黑色方形开口，N = 12） 和Lck-Casp9DN x Lck-Bax38/1（红色实心三角形，N = 11） 老鼠。按照材料和方法所述，对这些小鼠进行无淋巴结存活追踪。显示了分析的P值。ND（无损检测） = 在对照组没有任何事件的情况下无法确定。
图6
图6。Beclin 1+/-不会加速淋巴瘤的形成。
A类)从指定基因型的小鼠中分离出初级胸腺细胞。显示了Beclin 1和肌动蛋白作为负荷控制的免疫印迹。每只小鼠的Beclin 1与肌动蛋白的比率如免疫印迹所示。无淋巴瘤生存率的Kaplan-Meier分析B)比较Beclin 1+/+x Lck-Casp9DN（黑色方形开口，N = 12） 和Beclin 1+/-x Lck-Casp9DN（绿色实心菱形，N = 14） 老鼠，C类)比较Beclin 1+/+x Lck-Bax38/1（黑色方形开口，N = 11） 和Beclin 1+/-x Lck-Bax38/1（绿色实心菱形，N = 13） 小鼠，以及D类)比较Beclin 1+/+x Lck-Bax1（黑色方形，N = 15） 和Beclin 1+/-x Lck-Bax1（绿色实心菱形，N = 12） 显示了小鼠。按照材料和方法所述，对这些小鼠进行无淋巴结存活追踪。显示了分析的P值。
图7
图7。Beclin 1+/-对胸腺细胞的细胞死亡、增殖和活性氧水平没有影响。
A类)用Dex（1μM）处理来自指定基因型小鼠的分离胸腺细胞，使用Q-VD-OPh（50μM）作为Caspase抑制的阳性对照。随着时间的推移，确定了可行性。显示每组至少2只小鼠的平均值±SD。B） 对8至12周龄的所示基因型小鼠新鲜分离的胸腺细胞进行胸腺细胞DNA含量分析（顶面板）和胸腺细胞数分析（下面板）。每个符号对应于单个小鼠观察到的循环细胞百分比（%S/G2/M）和存活胸腺细胞总数。显示了各组的平均值±SD。C） 显示了在指定治疗后从Beclin 1+/+（灰色阴影）和Beclin 1+/-（黑线）小鼠分离的存活胸腺细胞的DHE和MitoSOX红色染色的代表性直方图重叠。Dex治疗24h后胸腺细胞的活力：7.3%（Beclin 1+/+）和8.9%（Beclin1+/-）。这些结果代表了至少3个独立实验。D） 显示了从Beclin 1+/+和Beclin 1+/-小鼠分离的存活胸腺细胞的DHE和MitoSOX红染色的代表性直方图重叠。对于每个图，显示了无caspase抑制的Beclin 1+/+细胞（灰色阴影）、有caspase抑制剂的Beclin-1+/+电池（黑线）和通过Casp9DN表达或Q-VD-OPh处理有caspase-抑制的Beclin 1+/-电池（绿线）。Dex治疗24h后胸腺细胞的存活率如下：7.3%（Beclin 1+/+）、20%（Beclin-1+/+x Casp9DN）和22%（Beclin1+/-x Casp9 DN）、42%（Beclin1+/+Q-VD-OPh）和43%（BeClin1+/-Q-VD-OPh）。
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