Gcn5 facilitates Pol II progression, rather than recruitment to nucleosome-depleted stress promoters, in Schizosaccharomyces pombe

doi:10.1093/nar/gkr255

.2011年8月；39(15):6369-79.

doi:10.1093/nar/gkr255。 Epub 2011年4月22日。

Gcn5促进波姆裂殖酵母Pol II的进展，而不是向核小体缺失的应激启动子募集

米里亚姆·桑索¹, 伊泽尔·巴尔加斯·佩雷斯, 路易斯·昆塔尔斯, 弗朗西斯科·安特奎拉, 何塞·艾特, 埃琳娜·伊达尔戈

附属公司

PMID： 21515633
预防性维修识别码：项目经理1159446
内政部： 10.1093/nar/gkr255

Gcn5促进波姆裂殖酵母Pol II的进展，而不是向核小体缺失的应激启动子募集

米里亚姆·桑索等。核酸研究. 2011年8月.

.2011年8月；39(15):6369-79.

doi:10.1093/nar/gkr255。 Epub 2011年4月22日。

作者

米里亚姆·桑索¹, 伊泽尔·巴尔加斯·佩雷斯, 路易斯·昆塔尔斯, 弗朗西斯科·安特奎拉, 何塞·艾特, 埃琳娜·伊达尔戈

附属

¹西班牙巴塞罗那蓬佩法布拉大学，爱国者88博士，E-08003。

PMID： 21515633
预防性维修识别码：项目经理1159446
内政部： 10.1093/nar/gkr255

摘要

在裂变酵母中，MAP激酶Sty1和转录因子Atf1调节多达400个基因以响应环境信号，并且这两种蛋白质都被证明以压力依赖的方式与它们的启动子结合。在基因搜索中，我们分离出了组蛋白H3乙酰转移酶Gcn5，它是SAGA复合物的一种成分，对氧化应激生存和这些基因的激活至关重要。应激时，Gcn5以Sty1和Atf1依赖的方式被招募到应激基因的启动子和编码序列中，导致组蛋白H3的乙酰化增强和核小体驱逐。出乎意料的是，RNA聚合酶II（Pol II）在Δgcn5细胞中的募集没有受到损害。我们在这里显示，即使在激活之前，应激基因在转录起始位点上游也显示出一个400-bp长的核小体亏损区域。应激处理不会改变启动子核小体结构，但诱导应激基因下游核小体的驱逐，这在Δgcn5细胞中未观察到。我们的结论是，虽然Pol II以转录因子依赖的方式被招募到无核小体应激启动子中，但Gcn5介导位于启动子下游的核小体的驱逐，从而使Pol II沿着基因高效地进行。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
Gcn5对Sty1-、Atf1-依赖应力响应的激活至关重要。(A类)*Δgcn5*SAGA复合物的菌株和其他突变体对氧化应激敏感。菌株972（WT）、AV18培养物的系列稀释液(*Δsty1*)，MS161(*Δgcn5*)，MS183(*Δada2*)，毫米184(*Δspt8*),*Δhfi1，Δspt20*和*Δspt7*被发现在富有的盘子上（YE + 三毫米高₂O（运行）₂; 是的 + 5 毫米高₂O（运行）₂)或不使用（YE）指示的H浓度₂O（运行）₂. (B)赖氨酸9和14组蛋白H3乙酰化的总水平取决于Gcn5。菌株972（WT）和MS112的蛋白质提取物(*Δgcn5*)用乙酰化H3K9/14或总H3抗体进行western blot分析，作为负荷对照。(C类)野生型和*Δgcn5*细胞。菌株972（WT）、AV18的培养(*Δsty1*)和MS112(*Δgcn5*)用1个毫米高₂O（运行）₂对于所指示的时间。用探针northern blot分析总RNAgpd1、ctt1、hsp9，或*srx1型*rRNA显示为负载对照。

**图2。**
Gcn5被招募用于应激基因并促进组蛋白H3乙酰化和核小体驱逐。(A类)Gcn5以依赖Atf1的方式与应激促进剂物理结合。HMP47菌株的培养(*gcn5-HA*WT）和MS176(*gcn5-HAΔatf1*)用1治疗（+）或不治疗（−）毫米高₂O（运行）₂用于15 使用仅覆盖启动子区域的引物，使用抗HA抗体进行最小ChIP实验，并通过实时PCR进行定量(*gpd1、ctt1、hsp9*和*srx1型*发起人；或启动子（prom）、编码（ORF）和终止（术语）序列*ctt1型*基因（右侧面板）。基因间区域的引物被用作阴性对照（对照）。所有ChIP实验的误差线（SEM）均根据生物三倍体计算得出。野生型细胞应激前后Gcn5-HA与ORF结合的显著差异由学生的t吨-测试(**P（P）* < 0.05). (B)Gcn5在应激依赖基因的启动子和编码区的应激作用下促进组蛋白H3乙酰化。菌株972（WT）和MS112的培养(*Δgcn5*)用1治疗（+）或不治疗（−）毫米高₂O（运行）₂用于15 如A所述，使用组蛋白H3（H3Ac）乙酰化赖氨酸9和14特异性抗体或针对未修饰的H3（F3）C末端结构域特异性抗体进行最小ChIP分析。乙酰化H3的免疫沉淀与总H3的百分比显示（%IP H3Ac/H3）。野生型与*Δgcn5*压力下ORF处的细胞由学生的t吨-测试(**P（P）* < 0.05). (C类)Gcn5促进H3水平降低，作为应激基因核小体驱逐的指示。图2B中的相同实验表示为总H3的免疫沉淀百分比（IP总H3百分比）。

**图3。**
缺乏Gcn5几乎不影响应激启动子处启动前复合物的形成，但严重损害Pol II的进展。(A类)在缺乏Gcn5的细胞中，Pol II向启动子的募集并没有缺陷。菌株393(*tbp1-HA（待定）*WT）和MS194(*tbp1-HAΔgcn5*)，表达Tbp1-HA，培养并用1 毫米高₂O（运行）₂用于15 如图2A所示，使用启动子区域的引物进行最小ChIP实验。(B)在缺乏Gcn5的细胞中，Pol II对编码序列的募集受到显著影响。菌株CN011(*rpb1-HA型*WT）和MS52(*rpb1-HAΔgcn5*)培养并用1处理（+）或不处理（−）毫米高₂O（运行）₂用于15 最小ChIP实验如图2A所示。野生型与*Δgcn5*ORF和终止（终末）位点的细胞在应激后由学生的t吨-测试(**P（P）* < 0.05). (C类)大Pol II亚基Rpb1的CTD的Ser5磷酸化。菌株972（WT）和MS161(*Δgcn5*)培养并用1处理（+）或不处理（−）毫米高₂O（运行）₂用于15 如图2A所示，对磷酸化Ser5（Ser5-CTD）的特定抗体进行了最小ChIP实验。(D类)大的Pol II亚基Rpb1在CTD的Ser2处的磷酸化。菌株972（WT）和MS112(*Δgcn5*)培养并用1处理（+）或不处理（−）毫米高₂O（运行）₂用于15 如图2A所示，对磷酸化Ser2（Ser2-CTD）的特定抗体进行了最小ChIP实验。野生型与*Δgcn5*压力下终止（足月）部位的细胞由学生的t吨-测试(**P（P）* < 0.05). (E类)大Pol II亚基Rpb1的CTD的Ser5磷酸化。应变和条件如（C）所示，但分析启动子处的Ser5占用情况（左侧面板）。右侧面板：与左侧面板相同的实验表示为Ser5磷酸化Rpb1-HA的免疫沉淀与总Rpb1-HA的百分比（%IP Ser5-CTD/Pol II）。

**图4。**
Pol II沿着*ctt1型*(A类)和*gpd1号机组*(B)基因：Gcn5介导启动子逃逸。菌株CN011(*rpb1-HA型*)和MS52(*rpb1 HAΔgcn5*)表达大分子Pol II亚单位Rpb1-HA，培养并用1 毫米高₂O（运行）₂在图中以秒为单位的时间点。如图2A所示，使用抗HA抗体进行ChIP实验。

**图5。**
CESR基因的启动子核小体特征。(A类)五个大核小体亏损区*S.pombe公司*基因激活前的CESR启动子。包含CESR基因的基因组区域的核小体定位*gpd1、ctt1、hsp9、srx1*和*在f1*。条纹和白色矩形分别表示未翻译和ORF。显示转录起始位点（黑色箭头）和NDR大小（粗条）。核小体以灰色椭圆形表示。数据来自全基因组核小体定位分析（40）和已发表的转录起始位点（50）。(B)50个基因中35个在氧化应激下表现出最高过表达的基因的核小体占用情况重叠(补充表S1). 单个基因的核小体图谱是在没有H的情况下确定的₂O（运行）₂.沿着基因组区域−500至+500平铺微阵列信号在平均35个基因的每个位置之前，插入每个基因（40）相对于TSS的bp。核小体占有率表示对数₂单核小体与裸基因组DNA信号的比率。

**图6。**
CESR基因的核小体扫描分析显示氧化应激后Gcn5依赖+1核小体驱逐。从菌株972（野生型，左图）和HU799的培养物中分离出单核小体(*Δgcn5*，右面板）之前（闭合圆，连续线）和之后（开放圆，虚线）2 最小值为1 毫米高₂O（运行）₂qPCR使用15对重叠引物对沿着1.15或1.0进行 kb，覆盖启动子、TSS（黑色箭头）和编码区（白色矩形）*ctt1型*(A类)或*gpd1号机组*(B)基因。误差条（SEM）由生物三重组（A）或重复组（B）计算。核小体以灰色椭圆形表示，其颜色强度与占用水平成正比。

**图7。**
描述Gcn5在两种酵母中的转录促进作用的方案。在*酿酒酵母*，Gcn5被要求促进信号依赖性核小体在*电话84*启动子（40）。SAGA也被招募到*CTT1型*启动子在热休克后，其核小体结构也发生改变（51-53）。相反*S.pombe公司*Gcn5依赖的CESR基因（例如*ctt1型*)在基础条件下没有核小体，因此，在信号激活时只需要清除下游核小体。

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