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.2011;12（4）：R37。
doi:10.1186/gb-2011-12-4-r37。 Epub 2011年4月13日。

灵长类DXZ4保守性的表征意味着X染色体上CTCF结合、阵列表达和串联重复序列组织的重要功能作用

克莉丝汀·麦克劳林 1, 布莱恩·查德威克
附属公司

灵长类DXZ4保守性的表征意味着X染色体上CTCF结合、阵列表达和串联重复序列组织的重要功能作用

克莉丝汀·麦克劳林等。 基因组生物学. 2011.

摘要

背景：比较序列分析是通过保守核苷酸序列识别功能相关非编码DNA元件的有力手段。大卫星DXZ4是一个多态、不间断、串联的3-kb重复单元阵列，仅位于人类X染色体上。虽然没有明显的蛋白质编码，但它的染色质组织表明该阵列在活性和非活性X染色体上的作用不同。

结果：为了鉴定DXZ4中的重要元素，我们探索了灵长类动物大卫星DNA序列和染色质构象的保存。我们发现新世界猴以外的DXZ4 DNA序列保护仅限于启动子和CTCF结合位点，尽管DXZ4仍然是一个富含GC的串联阵列。对猕猴染色质组织的研究表明，雄性和活性X染色体上的DXZ4被包装成异染色质，而在非活性X上，DXZ4是常染色的，并与CTCF结合。

结论：总之，这些数据表明DXZ4在X染色体上具有重要的保守作用，涉及表达、CTCF结合和串联组织。

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图1
图1
灵长类DXZ4的定位和串联排列.（a）直接标记荧光就地人DXZ4 BAC克隆（2272M5；红色）与人的杂交（FISH）公共后勤保障3BAC克隆（268A15；绿色）到雄性和雌性恒河猴中期染色体。白色箭头指向杂交X染色体。用DAPI对中期染色体进行复染，并将其转换为灰度级，以帮助观察FISH信号。（b）Southern印迹Xba公司我消化了灵长类基因组DNA，用脉冲场凝胶电泳分离，并与人地高辛标记的DXZ4探针杂交。灵长类和类群列在顶部，以M（雄性）或F（雌性）表示性别，包括恒河猴（R.macaque）、猪尾猕猴（P-T.Macaqe）、普通松鼠猴（Sq.monkey）和黑手蜘蛛猴（Sp.Monkeys）。左侧给出了以千为单位的大小。（c）溴化乙锭染色0.9%琼脂糖凝胶显示绿猴和猕猴BAC DNA被限制性内切酶消化Hin公司dIII和凝胶电泳分离。分子量标记的大小以千碱基为单位显示在左边。
图2
图2
DXZ4处简单重复序列的保守性.DXZ4由右向3-kb单体表示。在这个单体上标注的是DXZ4的区域，该区域在所有被检测的灵长类动物中都是保守的（红框），以及三个内部简单重复序列（蓝框）的位置，它们解释了DXZ4中的所有重复DNA。示意图的下方给出了人类简单重复序列，下方给出了其他灵长类动物的核苷酸组成。与人类序列不同的序列突出显示为黑色背景上的白色文字。水平线将大猿与小猿、旧世界猴子和新世界猴子区分开来。
图3
图3
DXZ4的DNA序列保守性.（a）由开放箭头表示的单个人类3-kb DXZ4单体示意图。顶部给出了以千碱基为单位的距离。下面的彩色条表示DXZ4的区域，对应于定义的启动子、CTCF和TFIID结合位点[12]，以及DXZ4在灵长类动物中最保守的402-bp区间。（b）显示DXZ4在灵长类动物中推断进化关系的系统发生树。对人类DXZ4的402个核苷酸区域进行序列比对，该区域在所有灵长类动物中最为保守（登录号为517至918的核苷酸[GenBank:HQ659140]）。核苷酸同一性百分比显示在最右边。灵长类的颜色编码如下：蓝色，大猩猩；粉红色，较小的猿类；黄色的旧大陆猴子；棕色，新大陆猴子；红色狐猴；绿色，加拉戈；黑色，眼镜猴。树图像是使用MUSCLE版本3.8[45]生成的。（c）通过点位分析预测了环尾狐猴DXZ4序列的高阶结构。单个3-kb DNA序列位于y轴上，而BAC克隆LB2-162N9的约70kb序列位于x轴上。使用NCBI Blast2的默认设置和Adobe Photoshop CS2中标记的输出图像生成点图。
图4
图4
雄性和雌性猕猴DXZ4 CpG甲基化模式.（a）由开放箭头表示的单个人类3-kb DXZ4单体示意图。沿顶部给出以千为单位的距离。下面的彩色条表示DXZ4的区域，对应于定义的启动子、CTCF和TFIID结合位点[12]，以及通过亚硫酸氢盐测序评估CpG甲基化的猕猴DXZ4 621-bp区间。（b）雄性和雌性恒河猴（R.macaque）和猪尾猕猴（P-T.macaque）样本中猕猴DXZ4 621 bp区域的CpG甲基化谱。区间内与CpG二核苷酸相对应的所有39个胞嘧啶残基均用圆圈表示。白色圆圈表示没有甲基化，而黑色圆圈表示甲基化C。每行圆圈表示来自独立克隆的序列数据。剖面图中的虚线表示偏离共识的序列，该序列在该位置没有C残基。甲基化的给定百分比是基于全轮廓内甲基化残基的数量。
图5
图5
H3K4me2在猕猴中期Xi的分布.（a）雌性恒河猴中期染色体（蓝色）通过间接免疫荧光显示H3K4me2（绿色）和H3K27me3（红色）的分布。Xi的位置由白色箭头指示。（b）雌性恒河猴中期Xi（蓝色）通过间接免疫荧光显示H3K4me2（绿色）和H3K27me3（红色）的分布。包括假常染色体区域的p臂尖端用白色方括号表示。Xi上的其他H3K4me2条带由白色箭头指示。（c）Xi上H3K4me2带分布的进一步示例，以证明模式的再现性。如（b）所示的信号。（d）人类女性端粒酶永生化视网膜色素上皮细胞（hTERT-RPE1）Xi显示H3K4me2（红色）信号的位置，如白色箭头和白色括号所示。
图6
图6
猕猴Xi间期常染色质标记的分布雄性和雌性恒河猴（R.macaque）间期细胞核的典型示例，显示了间接免疫荧光测定的H3K27me3（红色）、H3K4me3（绿色）、H3+36me2（绿色）和乙酰化赖氨酸（Pan-Ac-K，绿色）的分布。细胞核用DAPI（蓝色）复染。女性形象中的白色箭头表示了习的位置。
图7
图7
CTCF和H3K4me2与猕猴Xi的雌性特异性关联.（a）雌性恒河猴细胞核中Xi区H3K4me2‘点’（绿色）CTCF（红色）的共定标。白色箭头表示Xi（顶部面板）。下面的面板显示了一个放大的独立示例。白色箭头指向Xi的领土。细胞核用DAPI复染，收集的图像转换为灰度级以强调巴尔体。（b）染色质免疫沉淀法评估雄性和雌性恒河猴（R.macaque）和猪尾猕猴（P-T.Macaqe）染色质中H3K4me2、H3K9me3和CTCF与DXZ4的相关性。样品包括无模板对照（水）、输入DNA（输入）、显示抗体的免疫沉淀（IP）和非特异性兔血清（RS）。
图8
图8
DXZ4在雄性和雌性猕猴中的表达.（a）单个DXZ4单体的示意图，位置以千碱表示。单体下方的蓝色条表示通过RT-PCR评估的猕猴DXZ4区域的相对位置，并显示碎片的坐标。每个蓝色条都指向从雄性和雌性恒河猴cDNA中获得的相应RT-PCR数据。样品表明，从含有（+RT）和不含（-RT）（包括逆转录酶）的总RNA中制备的无模板对照（水）和cDNA。（b）雄性和雌性恒河猴cDNA中DXZ4表达的定量RT-PCR（qRT-PCR）分析。数据表示四个独立的三重qRT-PCR分析的平均值，黑色条表示标准误差。表达水平表示为GAPDH水平的百分比。（c）DXZ4的链特异性RT-PCR。用于启动反义或感义cDNA合成的引物的位置由左右箭头指示，DXZ4中的精确位置由坐标给出。红色方框表示PCR评估的反义转录本区域，蓝色方框表示感义转录本。下图是溴化乙锭染色琼脂糖凝胶的RT-PCR数据。样品包括无模板对照（Water）、带逆转录酶的股特异性引物（+RT）、带反转录酶的无股特异性引物（no oligo+RT）和无逆转录酶（-RT）的无引物。（d）雄性和雌性恒河猴细胞核DXZ4表达的RNA FISH分析。细胞核用DAPI（蓝色）复染。DXZ4表达式（红色）由白色箭头表示。白色箭头表示XIST RNA表达（绿色）。（e）雄性和雌性恒河猴（R.猕猴）和猪尾猕猴（P-T猕猴）Xa和Xi中DXZ4表达的定量分析(n个=50）。（f）RNA FISH分析中等收入国家2雄性和雌性恒河猴细胞核中相对于XIST（绿色）的表达（红色）。
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中的注释

  • 神秘的卫星。
    阿莫斯·W。 阿莫斯·W。 基因组生物学。2011;12(4):110. doi:10.1186/gb-2011-12-4-110。Epub 2011年4月13日。 基因组生物学。2011 PMID：21489319 免费PMC文章。

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