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.2011年5月20日；286(20):18104-17.
doi:10.1074/jbc。M110.208488。 Epub 2011年3月18日。

蛋白激酶Cα信号调节肠上皮DNA结合抑制剂1

方浩 1, 玛丽贝思·A·皮兹, 凯瑟琳·柯里, 克里斯汀·哈斯, 史蒂文·J种子屋, 阿德里安·R·布莱克, 詹妮弗·D·布莱克
附属公司

蛋白激酶Cα信号调节肠上皮DNA结合抑制剂1

方浩等。 生物化学杂志. .

摘要

越来越多的证据支持PKCα在肠上皮生长停滞和肿瘤抑制中的作用。相反，Id1转录阻遏物在该组织中具有促增殖和致瘤特性。在这里，我们确定Id1为PKCα信号的新靶点。使用高度特异性抗体和形态学/生物化学相结合的方法，我们确定Id1是一种限制肠隐窝细胞增殖的核蛋白。PKCα和Id1之间的关系得到了以下证据的支持：（A）隐窝/绒毛交界处Id1的下调与PKCα的激活相一致，（b）肠肿瘤中PKCα丢失与核Id1水平增加有关。操纵IEC-18非转化肠隐窝细胞中PKCα的活性确定PKCα通过Erk依赖机制抑制Id1 mRNA和蛋白。PKCα（而非PKCδ）也抑制结肠癌细胞中Id1的表达。发现Id1调节IEC-18和结肠癌细胞中的细胞周期蛋白D1水平，表明Id1抑制在PKCα的抗增殖/抑瘤活性中起作用。值得注意的是，在PKCα基因敲除小鼠的肠上皮中Id1表达升高，证实PKCα在体内调节Id1。PKCα在控制DNA结合因子抑制剂中的更广泛作用得到了其下调IEC-18细胞中Id2和Id3的能力的支持，尽管它们的抑制比Id1的抑制更温和。这项研究首次证明了特定PKC同工酶和DNA结合因子抑制剂之间的联系，并指出PKCα的作用→ Erk⊣识别码1→ 细胞周期蛋白D1信号轴在维持肠道内环境稳定中的作用。

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数字

图1。
图1。
Id1的表达与肠上皮中PKCα的激活呈负相关。 A类小鼠小肠Id1、cyclin D1和PKCα表达的免疫组织化学分析。面板i和ii（ii），使用高度特异的兔单克隆抗Id1抗体检测Id1。增殖性隐窝上皮细胞的细胞核可见Id1染色。Id1的下调发生在隐窝-绒毛连接处(J型)绒毛细胞中没有蛋白质(箭头)和Paneth细胞(P（P）).打开的箭头指向隐窝底部的假定干细胞，以及块箭头表示Id1-阳性基质细胞。面板iii和iv（四），增殖标记物cyclin D1的染色与Id1的染色相似(箭头如中所示面板i和ii（ii）).面板v和不及物动词，PKCα在增殖的隐窝细胞中广泛分布/不活动(实心箭头)并在绒毛的非分裂细胞中变成膜相关(打开的箭头)在Paneth细胞中(P（P）).支架、地下室；V（V），绒毛；C类，地穴；J型，隐窝-绒毛连接。面板vii通过在螯合缓冲液中连续清洗肠段，分离绒毛和隐窝部分，并对指示的蛋白质进行Western blot分析。正如隐窝标记细胞周期蛋白D1所证实的，组分1和2主要含有绒毛细胞，组分4和5含有隐窝细胞。在第3组中检测到不同水平的隐窝细胞标记。B类免疫组化分析小鼠结肠中Id1、cyclin D1和PKCα的表达。面板i和ii（ii）隐窝上皮细胞核内可见Id1和cyclin D1染色(箭头)但在表面粘膜的细胞核中不存在(箭头).块箭头基质Id1染色。第三小组，PKCα膜的结合/活性仅在表面粘膜的上皮细胞中明显(打开的箭头).实心箭头表明增殖的隐窝细胞中存在弥漫性细胞溶质/非活性PKCα。性虐待、表面粘膜；C类，地下室。酒吧，50微米。数据代表了3个以上的独立实验。
图2。
图2。
Id1在肠道肿瘤中过度表达。 A类APC小肠组织中Id1和PKCα的免疫染色最小值/+老鼠(面板i–iii)和来自偶氮甲烷的结肠组织(AOM公司)-治疗小鼠(面板iv–viii).面板i和ii、iv和v（v）,vii（七）和viii（八）显示相同组织中Id1和PKCα染色的连续切片。Id1通常在肿瘤细胞核中过度表达(T型)与正常隐窝细胞核相关的细胞(数控)单元格(面板i、iv、和不及物动词;箭头)而PKCα在肿瘤中丢失(面板ii、v、和viii（八）). 这个虚线在里面面板iv和v（v）划定正常组织和肿瘤组织之间的边界。中的高倍图像面板iii和vii（七）显示Id1在肿瘤细胞中的核定位。酒吧，50μm。数据代表了3个以上的独立实验。B类人正常结肠组织和肿瘤结肠组织的免疫组织化学分析。面板i、Id1在正常结肠粘膜和癌旁组织中的表达。肿瘤(T型)正常组织来自同一切片，图像处理相同。正常隐窝可见Id1的核染色(数控)上皮(实心箭头)但表面粘膜没有(性虐待;箭头)而在肿瘤细胞中可以看到更强烈的核染色。数据是对两名患者样本的代表性分析。第二组PKCα和Id1在人类结肠肿瘤中的表达呈负相关。对四名患者的肿瘤组织切片进行PKCα或Id1染色。注意，在缺乏PKCα的肿瘤中Id1的核高表达，而在保留这种酶表达的相对罕见的肿瘤中，Id1的缺失(底部面板).酒吧，50微米。
图3。
图3。
PKC信号下调IEC-18细胞中的Id1。 A类，PKC激动剂处理导致IEC-18细胞中Id1的下调。PMA处理细胞的蛋白质提取物（100 n米)，苔藓抑制素(布莱奥; 100牛顿米)，或DiC8（20μg/ml）2h后进行Id1和肌动蛋白免疫印迹分析（负荷控制）。B类，PKC激动剂对Id1的作用是PKC依赖性的。面板i用1μ米去除PDBu 24小时，并用载体处理细胞(C类)或100 n米项目管理局(P（P）)蛋白质提取和免疫印迹分析前2h。第二组，用1μ米Gö6983在添加车辆前30分钟或100 n米PMA持续2小时。C类，PKC激活下调Id1 mRNA。面板i，用PKC激动剂或载体处理细胞3 h，并对细胞总RNA进行实时RT-PCR分析。Id1 mRNA水平归一化为18 S rRNA，并显示为相对于载体对照。第二组，细胞经PDBU长期处理或在添加载体之前用Gö6983处理后，激动剂反应性PKC同工酶被耗尽(V（V）)或PMA持续3 h。提取RNA并通过实时RT-PCR进行分析。数据具有代表性(A类和B类)或平均值±S.E(C类)至少三个独立实验。星号表示统计上的不同(第页<0.05）来自仅车辆控制（*）或经PMA处理的控制（**）。
图4。
图4。
PKCα下调肠上皮细胞中的Id1。 A类PKCα的丢失与PKC激动剂处理的IEC-18细胞中Id1水平的恢复相关。面板i，用100n处理细胞米PMA，100牛顿米苔藓蛋白(布莱奥)，或20μg/ml DiC8进行Western blot分析。每个面板显示来自单个印迹的蛋白质；垂直实线为了清楚起见，请指出车道位置已更改的位置。第二组DiC处理的细胞中，Id1和PKCα的表达8或车辆行驶8和12小时。B类，Id1下调在PKCα过度表达细胞中延长。IEC-18细胞感染表达腺病毒lacZ公司或PKCα（10的m.o.i.）。48小时后，用PMA处理细胞，并按A类. The垂直虚线为了清楚起见，包括在内。内源性PKCα在lacZ公司-由于用于检测外源蛋白的抗体浓度较低和暴露时间较短，因此表达细胞。C类，PKCα活性的抑制可消除PKC激动剂诱导的Id1下调。用载体预处理IEC-18细胞(C类)或Gö6976添加PMA前30分钟(P（P）)或车辆(C类). 2小时后，提取蛋白质并对所示蛋白质进行Western分析。请注意，Gö6976对这些细胞中的PKCα具有特异性，因为它能够阻止该同工酶的下调，但不能阻止PKCδ或PKCϵ的下调（酶的下调依赖于催化活性）。数据代表至少三个独立实验。
图5。
图5。
Erk信号转导PKC激活对Id1表达的影响。 A类和B类，用载体预处理IEC-18细胞(C类)，LY294002（50μ米)，U0126（10μ米)或PD98059（50μ米)添加PMA之前(P（P）)或车辆(C类). 2小时后，提取蛋白质并对所示蛋白质进行Western blotting。每个面板显示单个斑点的数据；垂直实线为了清晰起见，请指出车道重新排列的位置。虚线为了清楚起见，包括在内。C类，IEC-18细胞，感染表达腺病毒lacZ公司（对照组）或PKCα，用PMA治疗(P（P）)或载体（乙醇，E类)在指定的时间内，对指定的蛋白质进行Western blotting。PKCα过度表达细胞中Id1的长时间抑制与持续的Erk激活有关。数据代表至少三个独立实验。
图6。
图6。
PKCα诱导结肠癌细胞Erk活化并下调Id1。 A类和B类，表明结肠癌细胞感染表达腺病毒lacZ公司当m.o.i为10时，PKCα或PKCδ。48小时后，提取蛋白质并对所示蛋白质进行Western blot分析。每个面板显示单个斑点的数据；这个垂直线在FET上的pERK印迹指示为了一致性已经重排了泳道的位置。数据代表至少三个独立实验。C类，HCT116细胞在添加载体（乙醇，E类)或100 n米项目管理局(P（P）)持续30分钟(左侧面板)或2小时(右侧面板). 然后对细胞进行蛋白质印迹分析。D类HCT116和DLD1细胞感染表达腺病毒lacZ公司或PKCα，并对总细胞RNA进行实时RT-PCR分析。Id1 mRNA水平标准化为18 S rRNA，并显示为相对于lacZ公司-转导细胞。数据是两个（DLD1）或三个（HCT116）独立实验的平均值（±S.E.）。*，与lacZ公司控制(第页< 0.05).
图7。
图7。
Id1调节肠上皮细胞中的细胞周期蛋白D1。 A类，敲除Id1导致细胞周期蛋白D1下调。用非靶向siRNA转染指示细胞(NS公司)或siRNA靶向大鼠（IEC-18）或人类（HCT-116和DLD1）Id1#1, #2、和#三指定用靶向大鼠Id1的三个独立siRNA之一转染的IEC-18细胞。转染后48小时，收获细胞，并通过蛋白质印迹分析所指示的蛋白质。B、 面板i表达EGFP-Id1融合蛋白或EGFP的IEC-18细胞(C类)通过Western blotting分析指示蛋白。第二组用载体处理表达EGFP-Id1融合蛋白的细胞(C类)或100 n米项目管理局(P（P）)提取和Western blot分析前2小时。数据代表了3个以上的独立实验。
图8。
图8。
Id1在PKCα的肠和结肠中被解除调节−/−老鼠。 A类年龄匹配的野生型和PKCα小肠Id1表达的免疫组织化学分析−/−老鼠。为了便于直接比较，在同一张幻灯片上同时对切片进行染色，并对图像进行相同的处理。箭头表明绒毛上有Id1染色(V（V）)PKCα的−/−老鼠。C类，地下室。酒吧，50微米。B类，Id1在分离的小肠上皮组分中的表达。分数，如图1所示A类对指示的蛋白质进行Western blot分析。细胞周期蛋白D1染色证实，组分1和2仅含有绒毛细胞，而组分4和5含有隐窝细胞。虚线为了清楚起见，包括在内。C类野生型和PKCα中Id1表达的免疫组织化学分析−/−冒号。这个箭头在里面面板ii和iv（四）表明表面粘膜上有Id1染色(性虐待)PKCα的−/−老鼠。酒吧，50微米。数据代表了3个以上的实验。
图9。
图9。
PKCα下调Id2和Id3。用载体、PMA或DiC处理IEC-18细胞8持续2小时(左侧面板)或在添加PMA或载药2小时之前，用载药（对照）、Gö6983或Gö686预处理30分钟(右侧面板). 提取RNA并对Id2进行实时RT-PCR分析(A类)或Id3(B类)mRNA。将数据归一化为18个SrRNA水平，并相对于载体对照进行表达，这些数据是三个独立实验±S的平均值。E。星号表示统计上的不同(第页<0.05）来自对照组（*），来自对照组和PMA单独（**）或来自PMA单独的（***）。
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