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.2011 5月20日;286(20):18104-17。
DOI:10107/JBC.M11020848。 EPUB 2011 3月18日。

蛋白激酶Cα信号调节肠上皮细胞DNA结合蛋白1的表达

附属
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蛋白激酶Cα信号调节肠上皮细胞DNA结合蛋白1的表达

方浩等。 生物化学杂志. .
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摘要

越来越多的证据支持PKCα在肠上皮细胞生长抑制和肿瘤抑制中的作用。相反,ID1转录阻遏物在该组织中具有促增殖和致瘤性。在这里,我们识别ID1作为PKCα信号的新靶点。使用高度特异性抗体和组合的形态学/生物化学方法,我们确定ID1是限制于增殖的肠隐窝细胞的核蛋白。PKCα和ID1之间的关系是通过证明:(a)在隐窝/绒毛交界处ID1的下调与PKCα激活一致,并且(b)PKCα在肠肿瘤中的丢失与核ID1水平的增加有关。在IEC-18非转化的肠隐窝细胞中,PKCα的活性决定了PKCα通过依赖ERK的机制抑制ID1 mRNA和蛋白。PKCα,而不是PKCδ,也抑制结肠癌细胞中Id1的表达。Id1在IEC-18和结肠癌细胞中调节cyclin D1水平,提示Id1抑制PKCα的抗增殖/抑癌活性。值得注意的是,在PKCα敲除小鼠肠上皮中Id1表达升高,证实PKCα在体内调节Id1。PKCα在抑制DNA结合因子抑制剂中发挥更广泛的作用是由于其在IEC-18细胞中下调ID2和ID3的能力所支持的,尽管它们的抑制比ID1更温和。这项研究首次证实了PKC同工酶与DNA结合因子抑制剂之间的联系,并指出PKCα-ERK-ID1~Cyclin D1信号通路在维持肠道稳态中的作用。

数据

图1。
图1。
ID1表达与肠上皮PKCα激活呈负相关。 小鼠小肠ID1、cyclin D1和PKCα表达的免疫组化分析面板I使用高度特异性兔单克隆抗ID1抗体检测ID1。在增殖的隐窝上皮细胞的细胞核中可见Id1染色。Id1的下调发生在隐窝绒毛交界处(J)和绒毛细胞中的蛋白质不存在(箭头和潘氏细胞(PANTES细胞)开箭指向隐窝底部的假定干细胞,和方块箭头提示ID1阳性基质细胞。第三板细胞增殖标志物Cyclin D1的染色,与ID1相似。箭头如在面板I面板V不及物动词PKCα在增殖性隐窝细胞中呈弥漫性分布/不活跃。实心箭在绒毛的非分裂细胞中形成膜开箭在潘氏细胞中托架隐窝舱;V绒毛;C隐窝;J隐窝绒毛交界处。第七小组通过螯合缓冲液中的肠段的连续洗涤,并对所指示的蛋白质进行Western印迹分析,分离绒毛和隐窝部分。由隐窝标记Cyclin D1证实,片段1和2主要含有绒毛细胞,而分数4和5含有隐窝细胞。在分数3中检测到不同水平的隐窝细胞标志物。小鼠结肠ID1、cyclin D1和PKCα表达的免疫组化分析面板I在隐窝上皮细胞的细胞核中可见Id1和cyclin D1染色。箭头但不存在于表面粘膜的细胞核内(箭头方块箭头间质Id1染色。第三小组PKCα膜结合/活性仅在表面粘膜上皮细胞中明显存在。开箭实心箭提示增殖性胞浆/不活跃PKCα在增殖性隐窝细胞中的存在。性虐待表面黏膜;C隐窝酒吧50μm。数据是3个独立实验的代表。
图2。
图2。
ID1在肠肿瘤中过度表达。 APC小肠组织中ID1和PKCα的免疫染色/+小鼠(面板Ⅰ-Ⅲ)和来自偶氮甲烷的结肠组织(声光调制器处理过的小鼠(第四小组-VIII面板I二、四V从同一组织中显示Id1和PKCα的连续切片。Id1在肿瘤细胞核中普遍表达过多(T细胞与正常隐窝的细胞核有关(细胞)数控细胞仪表板I、IV不及物动词箭头而PKCα在肿瘤中丢失(PKCα)第二、第五小组这个虚线进入第四小组V划定正常组织和肿瘤组织之间的边界。高倍率图像第三板显示Id1在肿瘤细胞中的核定位。酒吧50μm。数据是3个独立实验的代表。免疫组化分析正常人和肿瘤患者的结肠组织。面板IID1在正常结肠黏膜及邻近腺癌中的表达。TumorT正常组织来自同一节段,图像处理相同。在正常隐窝中可见Id1的核染色。数控)上皮实心箭但表面粘膜不存在(性虐待箭头而肿瘤细胞则可见更强烈的核染色。数据是来自两个病人的样本分析的代表。第二小组PKCα和ID1在人结肠肿瘤中的表达及相关性研究对四例肿瘤组织切片进行PKCα或ID1染色。注意Id1在缺乏PKCα的肿瘤中的高核表达和在一个相对罕见的肿瘤中缺乏Id1,它保留了酶的表达(底板酒吧,50μm。
图3。
图3。
PKC信号下调IEC18细胞中的ID1。 PKC激动剂治疗可导致IEC-18细胞中ID1的下调。PMA处理的细胞蛋白提取物(100 N))苔藓抑素布鲁伊100 N)或DIC(20μg/ml)2 h,免疫组化检测ID1和肌动蛋白(负荷对照)。PKC激动剂对Id1的影响是PKC依赖性。面板IPKC激动剂同工酶(PKCα,δ,-~(1))在IEC-18细胞中被消耗掉,其浓度为:PDBU持续24小时,PDBu被去除,并用载体治疗细胞。C或100 N聚甲基丙烯酸甲酯在蛋白提取前2小时,并对所指示的蛋白质进行免疫印迹分析。第二小组细胞用1μm预处理。Go 6983在添加车辆前30分钟或100 NPMA为2小时。CPKC激活下调ID1 mRNA的表达。面板I将细胞用PKC激动剂或载体处理3小时,并对总细胞RNA进行实时RT-PCR分析。ID1 mRNA水平被归一化至18 S rRNA,并显示为相对于车辆控制。第二小组通过PDBU延长治疗或用GO 6983处理前添加细胞,使细胞激动剂应答的PKC同工酶耗尽。V或3小时后,用实时RT-PCR法提取RNA。数据是代表性的(或平均±S.C)至少有三个独立的实验。星号有统计学差异< 0.05)仅由车辆控制(*)或PMA处理的控制(**)。
图4。
图4。
PKCα下调肠上皮细胞中的ID1。 PKCα的丢失与PKC激动剂治疗的IEC-18细胞中ID1水平的恢复有关。面板I用100 N处理细胞。PMA,100 N苔藓抑制素布鲁伊)或20μg/ml DIC对所示时间进行Western blot分析。每个面板显示单个印迹的蛋白质;垂直实线为清楚起见指示车道的位置在哪里被改变。第二小组Id1和PKCα在DIC细胞中的表达或车辆8和12小时。在PKCα过度表达细胞中,ID1下调延长。腺病毒介导的IEC-18细胞感染拉茨或PKCα(M.O.I. 10)。48小时后,用PMA处理细胞并进行分析。. 这个垂直虚线包括清楚。内源性PKCα不明显拉茨-表达细胞由于抗体浓度低和暴露时间短,用于检测外源蛋白。C抑制PKCα活性可抑制PKC激动剂诱导的ID1下调。IEC-18细胞用载体预处理C或在加入PMA前30分钟的GO 6976(或车辆C2小时后,提取蛋白质并对所指示的蛋白质进行西式分析。值得注意的是,G 6976对这些细胞中PKCα具有特异性,这是由于其阻断这种同工酶的能力,而不是PKCδ或PKC的能力(酶的下调依赖于催化活性)。数据是至少三个独立实验的代表。
图5。
图5。
ERK信号介导PKC激活对Id1表达的影响。 IEC-18细胞用载体预处理C),LY29 42000(50μm))(U0126(10μ)或PD98059(50μ))在加入PMA之前(或车辆C2小时后,提取蛋白质并对所指示的蛋白质进行Western印迹。每个面板显示来自单个印迹的数据;垂直实线指示为了清楚起见车道已经重新排列。虚线为了清晰起见包括在内。CIEC-18细胞感染腺病毒表达拉茨(对照)或PKCα,用PMA处理。或车辆(乙醇)e用于指示的时间,并对所指示的蛋白质进行Western印迹。延长PKCα过度表达细胞中Id1与持续ERK激活有关。数据是至少三个独立实验的代表。
图6。
图6。
PKCα诱导结肠癌细胞ERK活化,下调ID1表达。 用腺病毒表达结肠癌细胞拉茨PKCα或PKCδ在M.O.I中为10。48小时后,提取蛋白质并对所指示的蛋白质进行Western blot分析。每个面板显示来自单个印迹的数据;垂线在FET PARK印迹表明,车道已经重新排列的一致性。数据是至少三个独立实验的代表。C将HCT116细胞用载体(DMSO)或10μm U0126(DMSO)预处理30分钟后加入载体(乙醇),e或100 N聚甲基丙烯酸甲酯)30分钟左面板)或2小时右面板对细胞进行蛋白质印迹分析。D用腺病毒表达HCT116和DLD1细胞。拉茨或PKCα,并进行实时RT-PCR分析。ID1 mRNA水平被标准化为18 S rRNA,并显示为相对拉茨转导细胞。数据是两个(DLD1)或三(HCT116)独立实验的平均值(±S.E)。*,显著不同于拉茨控制(控制)< 0.05)。
图7。
图7。
Id1调节肠上皮细胞的细胞周期蛋白D1。 Id1的敲除导致细胞周期蛋白D1的下调。用非靶向siRNA转染细胞纳秒或靶向大鼠(IEC-18)或人(HCT-116和DLD1)ID1的siRNA。γ,γ用靶向大鼠ID1的三个独立siRNA之一转染IEC-18细胞。转染48 h后,用Western印迹法检测细胞的表达情况。B,面板I表达EGFP ID1融合蛋白或EGFP的IEC-18细胞C用Western blot分析所标记蛋白。第二小组用载体处理表达EGFP ID1融合蛋白的细胞(C或100 N聚甲基丙烯酸甲酯在提取前2小时和Western blot分析。数据代表了3个独立的实验。
图8。
图8。
ID1在PKCα的肠和结肠中被解除调节“/”老鼠 年龄匹配野生型和PKCα小肠ID1表达的免疫组化分析“/”老鼠为了允许直接比较,切片同时在相同的幻灯片上染色,并且图像被相同地处理。箭头指示绒毛上的Id1染色(VPKCα“/”老鼠C隐窝酒吧,50μm。ID1在小肠上皮部分的表达。分离,如图1所示对标记蛋白进行Western blot分析。Cyclin D1染色证实,部分1和2仅含有绒毛细胞,而组分4和5含有隐窝细胞。虚线为了清晰起见包括在内。CId1在野生型和PKCα表达的免疫组化分析“/”冒号。这个箭头进入面板二表面黏膜上的ID1染色性虐待PKCα“/”老鼠酒吧50μm。数据代表了3个实验。
图9。
图9。
PKCα下调ID2和ID3。用载体、PMA或DIC治疗IEC-18细胞。2小时(左面板或在加入PMA或车辆2小时之前,用车辆(对照)、GO 6983或GO 6976预处理30分钟(右面板提取RNA并对ID2进行实时RT-PCR分析。或ID3mRNA。归一化至18 S rRNA水平并相对于车辆控制表达的数据是三个独立实验±S.E的平均值。星号有统计学差异< 0.05)从对照(*),从对照和PMA单独(**)或从PMA单独(**)。

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