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.2011年4月；13(4):383-93.
doi:10.1038/ncb2216。 Epub 2011年3月20日。

肌球蛋白-II反应性局部黏附蛋白组的分析揭示了β-Pix在局部黏附成熟负调控中的作用

郭建成（Jean-Cheng Kuo） 1, 韩雪梅, 小承德, 约翰·耶茨（John R Yates）第三, 克莱尔·沃特曼
附属公司

肌球蛋白-II反应性局部黏附蛋白组的分析揭示了β-Pix在局部黏附成熟负调控中的作用

郭建成（Jean-Cheng Kuo）等。 Nat细胞生物学. 2011年4月.

摘要

局灶性粘连经历肌球蛋白II介导的成熟，其中它们生长并改变组成，以调节细胞迁移、生长和分化的整合素信号传导。为了确定肌球蛋白II活性如何影响局部黏附成分，我们对分离的局部黏附进行了蛋白质组学分析，并比较了具有和不具有肌球蛋白Ⅱ抑制作用的细胞中局部黏附的蛋白质丰度。我们鉴定了905个局部黏附蛋白，其中459个随着肌球蛋白II抑制而大量变化，从而定义了肌球蛋白-II反应性局部黏附蛋白质组。肌球蛋白-II反应性局部黏附蛋白质组中73%的蛋白质丰度通过收缩性增强，包括参与Rho介导的局部黏附成熟和内吞及钙蛋白酶依赖的局部黏着分解的蛋白质。在肌球蛋白II抑制期间，肌球蛋白-II反应性局部黏附蛋白质组中27%的蛋白质，包括与Rac介导的跛足前突有关的蛋白质，在局部黏附中富集，这表明局部黏附蛋白的募集也受到收缩性的负向调节。我们重点关注Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子β-Pix，记录其在局部黏附成熟负调控和促进跛足前突和局部黏附转换以驱动细胞迁移中的作用。

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数字

图1
图1。FA隔离方法的开发和验证
（a） 从HFF1细胞中分离FA和通过蛋白质组学分析进行成分鉴定的准备的流程图。完整的HFF1细胞（顶面板）和分离的HFF1 FA（中面板）进行免疫染色，以定位作为FA标记物的帕西林和F-actin（指骨样蛋白）。比例尺=20μm。（b） 完整细胞（n=7个细胞1219 FA）、低张休克细胞（n=7个细胞944 FA）和分离FA（n=9个细胞，1217 FA）图像中分段含paxillin FA的大小分布直方图。条形图显示SD。在这三个样品中，FA在每个尺寸范围内的百分比没有发现显著差异（天然：2.91+/-0.29μm2，低渗性休克：2.90+/-0.82μm2，隔离：2.94+/-0.57μm2). （c） Western blot比较总细胞裂解物（T）、分离的FA组分（F）（免疫耗竭前）和细胞体组分（c）中的蛋白质浓度（每个通道中装载相同的总蛋白质）。右侧所示的比率（F/C）（n=3~4个实验，+/−SD）表示分离的FA组分：细胞体组分之间的蛋白质相对浓度。注意，这并不反映分离的FA级分和细胞体级分中蛋白质的绝对量。
图2
图2。分离FA的蛋白质组
（a） 用于MudPIT MS分析数据的标准，用于组装分离FA中存在的可检测和可复制的蛋白质列表。（b）维恩图和分离FA鉴定的蛋白质分类。括号中显示了每类蛋白质的数量。（c） 饼图显示了根据功能分类的可复制列表中蛋白质的百分比。
图3
图3。肌球蛋白II依赖性比率的发展，以表征肌球蛋白Ⅱ抑制对分离脂肪酸蛋白质丰度的影响
（a） 通过巴西林的免疫染色显示，通过布利司他丁治疗（50μM，2h）抑制肌球蛋白II对来自完整细胞或分离FAs的FAs组织和形态的影响。比例尺=20μm。（b） 完整的滤泡抑制素处理的HFF1细胞（n=3个细胞526个FA）和分离的滤泡阻遏素处理的FA（n=4个细胞252个FA。条形图显示SD。在完整细胞的FA和分离的FA之间，在每个大小范围内的FA百分比没有发现显著差异。（c） 计算肌球蛋白II依赖性比率的程序图，表示对照细胞和滤泡抑制素处理细胞之间分离FA中蛋白质丰度的变化。
图4
图4。肌球蛋白Ⅱ对常见生物途径中蛋白质FA丰度的集体调节
（a） 不同功能类别的蛋白质数量在分离的脂肪酸中表现出丰度变化（相对于对照组），以应对镇静剂治疗。丰度的两倍差异（肌球蛋白II依赖性比率（MDR）<0.5或>2）被视为高置信度显著变化。（b） ~（e）蛋白质由方框表示，方框根据其肌球蛋白II依赖性比率（MDR）的大小进行彩色编码，如补充图S4所示。（b） 肌球蛋白II介导的FA富集蛋白参与FA成熟和应激纤维。（c） 肌球蛋白II对调节整合素激活和肌动蛋白连接的FA蛋白的调节。（d） 肌球蛋白II介导的钙蛋白酶依赖性和细胞内吞依赖性FA分解相关蛋白的FA富集（e）肌球蛋白Ⅱ介导的Rac1激活和跛足肌动蛋白跑步机相关蛋白的FA减少。
图5
图5。β-PIX的FA丰度受肌球蛋白II介导的成熟负调控
（a） 用β-PIX抗体对来自对照细胞和50μM滤泡抑制素处理细胞的分离FA组分（相等的总蛋白负载）进行Western blot。通过western blot（Fold，n=3个实验，+/−SD）或MudPIT MS分析（Fold in MS）确定的分离FA中的折叠富集，如下所示。（b） 对照组和50μM滤泡抑制素处理（blebb）细胞中免疫定位帕西林（绿色）和β-PIX（紫色）的TIRF图像。左栏中6.5μm×6.5μm方框区域在右三栏中放大，比例尺=1μm。（c） 帕西林或β-PIX免疫荧光信号的平均密度比（强度/μm2)在与对照细胞（滤泡抑素/对照细胞）相关的滤泡抑制素处理的分节FA内或小的（<2μm2)相对于大（>2μm2)控制单元中的FA（小/大）。n=9个滤泡抑制素处理细胞，9个对照细胞，条形图显示SD，**，p<0.05。（d） 用β-PIX抗体对来自1.5kPa和55kPa底物（总蛋白负载相等）上的细胞的分离的FA级分进行蛋白质印迹。通过western blot（Fold，n=3个实验，+/−SD）测定分离FA中的折叠富集，如下所示。（e） 1.5kPa和55kPa底物上细胞的免疫定位帕西林（绿色）和β-PIX（紫色）图像。左栏中6.5μm×6.5μm方框区域在右三栏中放大，比例尺=1μm。（f） 帕西林或β-PIX免疫荧光信号的平均密度比（强度/μm2)在1.5kPa相对55kPa的电池分段FA内。n=在1.5kPa基板上镀6个电池，在55kPa基板上镀层6个电池。条形图显示SD，**，p<0.05。（g） （左）eGFP-β-PIX和mApple-Paxilin的延时双色TIRF系列图像。时间（秒），比例尺=1μm。（右）用箭头标记的FA中随时间的归一化综合荧光强度（mApple paxillin，红色；eGFP-β-PIX，蓝色）和FA大小（灰色）。（h） （左）Y27632（10μM）灌注期间（时间=0s）eGFP-β-PIX和mApple-Paxilin的延时双色TIRF系列图像，以抑制ROCK介导的肌球蛋白II活性。布利司他丁在蓝光下具有光毒性，因此不能使用。时间（秒）。比例尺=1μm。（右）装箱区域FA中随时间变化的归一化综合荧光强度（mApple-paxilin，蓝色；eGFP-β-PIX，橙色）。
图6
图6。β-Pix对跛足足形成和Rac1激活的调节作用
（a） GFP-β-PIX（红色）-过表达的HFF1细胞在50μM的blebbistatin（2小时）处理中进行免疫染色，其中paxillin定位新生FA（绿色），cortactin定位突出的lamellipodia（蓝色）。左侧列中的6μm x 6μm方框区域在右侧和底部三列中放大，比例尺=1μm。（b） 对表达非沉默或β-PIX-沉默shRNA（与c中的β-PIX#1相同）的HFF1细胞的皮质素（紫色）和帕西林（绿色）免疫染色，分别用50μM布利他汀（blebbistatin）或不用（对照）处理。比例尺=20μm。右栏显示了在上述条件下，皮质素染色的细胞面积相对于细胞总面积的比率。n=10个细胞，+/-标准偏差**，p<0.05。（c） β-PIX沉默对抑泡素诱导的Rac1激活的影响。表达非沉默（non）或β-PIX-沉默shRNA（β-PIX#1和β-PIX#2表示β-PIX shRNA的不同序列靶点）的HFF1细胞单独或与myc标记的小鼠β-PIX（myc-β-PIX）一起用50μM的布利司他丁处理2小时（blebb）或不处理，并制备细胞裂解物。western blot检测GST-PAK-CRIB下拉法从裂解物中分离出的GTP-结合Rac1（GTP-Rac）水平。western blot检测输入裂解液中Rac1（总Rac）、β-PIX和微管蛋白的蛋白水平。通过western blot（Fold）测定的GTP-Rac和β-PIX水平相对于对照组的变化如下所示。
图7
图7。β-PIX对FA动力学和细胞迁移的影响
（a） 对照组、GFP-β-Pix过表达、非沉默shRNA-表达或β-Pix表达细胞（与图7c中的β-Pix#1相同）中FAs的Paxillin免疫染色。比例尺=20μm。（b） 在（a）所述条件下，外围（细胞边缘在15μm范围内）分段FA的尺寸分布直方图。n=FA数量。条形图显示SD.**，p<0.05。（c） （左）在表达非沉默或β-Pix沉默（与图7c中的β-Pix#1相同）shRNAs的迁移细胞中FA转换期间，mApple-Paxilin的延时TIRF系列图像。比例尺=1μm。（右）用箭头突出显示的FA中随时间变化的标准化荧光蛋白强度。（d） FA平均寿命（β-PIX沉默：40.19±2.38min，对照：27.11±3.00min）和（e）在（c）所述条件下，FAs中mApple-Paxilin的最大总强度（d和e，非沉默：n=19 FAs/5细胞；β-PIX闪烁：n=15 FAs/6细胞，条形图显示SD），**p<0.05。（f） 表达非沉默或β-Pix-silencing HFF1 shRNAs的细胞迁移速度（含或不含50μM抑泡剂）。n=对照细胞数量/抑制泡球蛋白处理的细胞数量，条形图显示SD。（g）肌球蛋白II收缩力对前缘FA组成和功能影响的模型。
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