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.2011年5月15日；81(10):1211-8.
doi:10.1016/j.bcp.2011.03.005。 Epub 2011年3月23日。

4-甲基邻苯二酚诱导的氧化应激诱导转移性黑色素瘤细胞内在凋亡途径

弗洛拉斯蒂娜·佩顿 1, 鲁穆·博斯, 威廉·阿尔沃思, 阿丹基·P·库马尔, 丽塔·戈什
附属公司

4-甲基邻苯二酚诱导的氧化应激诱导转移性黑色素瘤细胞的内在凋亡途径

弗洛拉斯蒂娜·佩顿等。 生物化学药理学. .

摘要

与厚型黑色素瘤（>4mm）相关的死亡率稳步上升。虽然对该病生物学的了解有所提高，但对于晚期转移性黑色素瘤患者的有效治疗策略仍然难以捉摸。因此，需要对具有治疗潜力的药物进行更深入的测试，以提高转移性恶性黑色素瘤患者的生存率。我们测试了槲皮素代谢产物4-甲基邻苯二酚的能力；一种天然化合物，通常存在于多种水果中，具有抗黑色素瘤的潜力。我们的结果表明，4-甲基邻苯二酚抑制培养的黑色素瘤细胞的增殖，而不影响正常人表皮黑素细胞的生长。此外，转移性黑色素瘤细胞在软琼脂上形成集落的能力也受到抑制。4-甲基邻苯二酚可引起细胞周期G2/M期的细胞聚集并诱导细胞凋亡。4-甲基邻苯二酚处理后活性氧物种增加，通过固有线粒体途径导致细胞凋亡。治疗还抑制了Akt介导的细胞存活，Akt是黑色素瘤细胞存活的关键因素。综上所述，我们的结果表明，4-甲基邻苯二酚对转移性恶性黑色素瘤细胞具有细胞毒性，同时保留正常黑色素细胞，应作为恶性黑色素癌的潜在候选药物进行进一步测试。

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数字

图1
图1
4-甲基邻苯二酚的结构
图2
图2
4-甲基邻苯二酚处理引起的生长抑制。A类随着4-甲基邻苯二酚剂量的增加，细胞增殖受到抑制。CellTiter 96非放射性细胞增殖试验（Promega公司）按方法所述进行。在处理72小时后，在570 nm处测量formazan产品的生产吸光度。结果是三次单独实验的平均值，一式三份。NHEM，正常人表皮黑素细胞；Sbcl2，原发性黑色素瘤细胞；1205Lu，转移性黑色素瘤细胞B。4-甲基邻苯二酚处理后抑制细胞存活。对数生长的1205Lu细胞未经处理，或用材料和方法中描述的溶剂或4-甲基邻苯二酚处理。14天后，用乙醇固定细胞，用0.005%结晶紫染色并计数。图中显示了存活细胞与未处理细胞相比的百分比。该图是两个单独实验的平均值±SD，共进行三次。C、。1205Lu人黑色素瘤细胞的锚定非依赖性生长。用增加浓度的4-甲基邻苯二酚处理细胞，并按方法所述将其置于软琼脂上。14天后，用0.02%对碘硝基四氮唑对菌落进行染色，并对八个不同区域的菌落进行计数。所示数据为重复进行的两个独立实验的平均±SD。
图3
图3
4-甲基邻苯二酚处理诱导活性氧物种。用溶剂对照处理1205Lu细胞，第三种-过氧化丁基氢（TBHP）和增加4-甲基邻苯二酚浓度8h。按照供应商建议（Invitrogen），向试管中添加1μM二氯二氢荧光素二醋酸酯（DCFDA）。荧光显微镜用于记录细胞因4-甲基邻苯二酚处理而遭受氧化应激的图像。A组，未经处理的细胞；B、 溶剂处理电池；C、 TBHP；D、 5微克/毫升；E、 10μg/ml和F，25μg/ml 4-甲基邻苯二酚。所示图像是三个独立实验的代表。三个独立实验±SD的平均值如面板3G中的图表所示。
图4
图4
4-甲基邻苯二酚治疗的流式细胞术分析。用10μg/ml 4-甲基邻苯二酚处理1205Lu细胞，分别于4h、16h和24h进行流式细胞术分析。0h时间点表示治疗后立即采集的细胞。所示数据是三个独立实验的代表。
图5
图5
4-甲基邻苯二酚治疗后诱导细胞凋亡。A-D公司转移性黑色素瘤细胞（1205Lu）在用溶剂对照（DMSO；图A）处理和用增加剂量（5、10和25μg/ml）的4-甲基邻苯二酚处理后的显微照片（图B-D分别）。显示24小时后细胞形态的变化。凋亡细胞表现为膜起泡、细胞质收缩和核浓缩。照片是用连接在尼康显微镜上的相机拍摄的。照片放大10倍。E.公司。对数生长的细胞用增加剂量的4-甲基邻苯二酚处理18小时（面板E）。按照方法所述，收集细胞并用FITC-Annexin V标记。流式细胞术检测Annexin V阳性细胞。所示数据是三个独立实验±SD的平均值。F、。对数生长的细胞用4-甲基邻苯二酚处理，延长时间（面板F）。按照方法所述，收集细胞并用FITC-Annexin V标记。流式细胞术检测细胞凋亡。所示数据是三个独立实验的平均±SD。
图5
图5
4-甲基邻苯二酚治疗后诱导细胞凋亡。A-D公司转移性黑色素瘤细胞（1205Lu）在使用溶剂对照（DMSO；面板A）和增加4-甲基邻苯二酚剂量（5、10和25μg/ml）处理后的显微照片（分别为面板B-D）。显示24小时后细胞形态的变化。凋亡细胞表现为膜起泡、细胞质收缩和核浓缩。照片是用尼康显微镜上的相机拍摄的。照片放大10倍。E.公司。对数生长的细胞用增加剂量的4-甲基邻苯二酚处理18小时（面板E）。按照方法所述，收集细胞并用FITC-Annexin V标记。流式细胞术检测Annexin V阳性细胞。所示数据是三个独立实验±SD的平均值。F、。对数生长的细胞用4-甲基邻苯二酚处理，延长时间（面板F）。按照方法所述，收集细胞并用FITC-Annexin V标记。流式细胞术检测细胞凋亡。所示数据是三个独立实验的平均±SD。
图6
图6
4-甲基邻苯二酚处理诱导细胞存活和凋亡相关蛋白的Western blot分析。从对照细胞和4-甲基邻苯二酚处理的（5、10和25μg/ml）细胞中提取全细胞或线粒体提取物，处理18小时。用SDS-PAGE对等量的提取物进行分级，并用抗Akt、pAkt（S473）、caspase 3、caspase9、Bax、Bcl2和细胞色素C的抗体进行检测。用β-actin对全细胞提取物印迹进行标准化，用Porin对线粒体印迹进行标准。用三组不同的提取物进行蛋白质印迹和分析。Caspase 3抗体与32、28和17kDa形式的Caspase 3反应，并且还用该抗体检测到额外的非特异性条带。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9与凋亡细胞中半胱氨酸蛋白酶9的酶原形式（46-48 kDa）和p32亚单位反应。
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