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.2011年3月8日；6（3）：e16746。
doi:10.1371/journal.pone.0016746。

PINK1和Parkin基因突变损害人成纤维细胞中线粒体泛素化

阿列克桑达尔·拉科维奇 1, 安妮·格吕纽瓦尔德, 扬·科特维茨, 诺伯特·布吕格曼, 彼得·普拉姆索尔, Katja Lohmann女士, 克里斯汀·克莱恩
附属公司

PINK1和Parkin基因突变损害人成纤维细胞中丝裂霉素的泛素化

阿列克桑达尔·拉科维奇等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

PINK1和Parkin突变导致隐性帕金森病（PD）。在果蝇和SH-SY5Y细胞中，Parkin被PINK1征募到受损的线粒体中，在线粒体中泛素化Mitofusins，从而促进线粒体分裂和有丝分裂。在这里，我们研究了内源性PINK1和Parkin突变对线粒体融合和裂变因子泛素化以及线粒体网络结构的影响。用线粒体膜电位（Δψ）抑制剂或H（2）O（2）处理对照成纤维细胞，导致Mfn1/2泛素化，但OPA1或Fis1没有泛素化。在治疗后1小时内，通过PINK1/Parkin通路观察到了米托福星的泛素化。Δψ和泛素蛋白酶体系统（UPS）联合抑制后，未检测到线粒体泛素化。关于形态学变化，我们观察到在线粒体应激下PD患者细胞中线粒体分支增加的趋势。我们首次在PD患者源性细胞中证明PINK1和Parkin的突变损害了线粒体的泛素化。在存在UPS抑制剂的情况下，泛素化的Mitofusin被UPS重泛素化，但没有降解，这表明UPS参与了Mitofussin降解。

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数字

图1
图1。缬氨霉素治疗后线粒体融合和裂变蛋白的表达。
来自健康对照组的成纤维细胞，纯合子粉红色1突变体和纯合子帕金突变体在基础条件下培养或用1µM缬霉素处理12 h。通过Western blotting研究（A）Mfn2、（B）OPA1和Fis1的蛋白水平。缬氨霉素暴露导致对照组Mfn2水平下降，但未导致对照组Mfn2水平下降粉红色1-或帕金-突变细胞。在任何细胞培养物中，OPA1和Fis1的蛋白质水平均不受此处理的影响。在基础和胁迫条件下，线粒体标记VDAC1的表达在突变体和对照中具有可比性。（C） 突变细胞用打乱的siRNA孵育，Mfn1型小干扰RNA，Mfn2公司siRNA或其组合Mfn1型和Mfn2公司用Mfn2抗体进行40 h的siRNA免疫印迹分析。Mfn2水平仅在以下情况下下降Mfn2公司使用siRNA，证实了我们研究中使用的抗Mfn1抗体的特异性。β-actin作为负荷控制。Fis1–裂变1；Mfn1–丝裂原融合蛋白1；Mfn2–丝裂原融合蛋白2；OPA1–视神经萎缩1；VDAC1–电压依赖性阴离子通道1。
图2
图2。安定霉素治疗后Mfn2的泛素化。
用1µM缬霉素处理健康对照组的成纤维细胞6小时。使用Mfn2抗体免疫沉淀来自未处理和缬霉素经处理对照组的全细胞裂解物。免疫沉淀物用泛素抗体通过Western blotting进行分析（左图）。随后，清洗膜，并用Mfn2抗体重新制备膜（右面板）。泛素化形式的Mfn2（单泛素化和多泛素化）仅存在于缬氨霉素治疗的对照组中。Mfn2–丝裂原融合蛋白2；Ub-Mfn2–泛素化丝裂原融合蛋白2。
图3
图3。安定霉素治疗后泛素化Mfn2的线粒体定位。
对照成纤维细胞在基础条件下培养或用1µM缬氨霉素处理6 h。收集细胞并通过Western blotting分析线粒体和细胞溶质部分。测定了Mfn2的亚细胞定位。使用VDAC1和β-肌动蛋白抗体确认细胞分离的质量。只有在安定霉素应激后才能观察到Mfn2的泛素化形式，仅在线粒体部分发现。较长时间的印迹显示了几个分子量较高的Mfn2条带，表明Mfn2-多泛素化（扩大的剪切区）。Cyt–细胞溶质部分；线粒体部分；Mfn2–丝裂原融合蛋白2；VDAC1–电压相关阴离子通道1。
图4
图4。Mfn2泛素化的抢救。
对照组的成纤维细胞粉红色1和a帕金突变体转染了一个空载体，该载体包含粉红色1-V5或包含驻车标志转染后20小时，细胞在基础条件下培养或用1µM缬霉素处理额外6小时。使用V5和FLAG抗体进行的Western blot分析显示，转染后处理和未处理的对照细胞中的条带大小分别为全长/裂解PINK1和Parkin，确认实验成功（上面板）。（A） 在对照组中，安定霉素治疗后，在所有三个实验中均检测到泛素化Mfn2。（B） 在粉红色1-突变细胞，Mfn2在压力下的泛素化通过过度表达粉红色1-V5但不是通过过度表达FLAG驻车.（C）英寸帕金-泛素化的突变体成纤维细胞Mfn2仅在转染驻车标志.FL–全长；Mfn2–丝裂原融合蛋白2；Ub-Mfn2–泛素化丝裂原融合蛋白2。
图5
图5。暴露于环氧缩宫素可防止Mfn2的泛素化。
来自（A）健康对照组，（B）纯合子的成纤维细胞粉红色1突变体和（C）纯合子帕金用1µM缬霉素单独处理突变体（左面板），或用1¦µM valinomycin加10µM环氧霉素处理突变体。在不同的时间点提取蛋白质并进行蛋白质印迹分析。在对照细胞中，安定霉素处理在孵育1小时后启动Mfn2的泛素化。同时暴露于环氧肟酸可防止这种影响。线粒体标记物VDAC1和细胞溶质标记物β-肌动蛋白作为负荷对照。Mfn2–丝裂原融合蛋白2；Ub-Mfn2–泛素化的线粒体融合蛋白2；VDAC1–电压依赖性阴离子通道1。
图6
图6。暴露于巴非霉素对Mfn2泛素化没有影响。
对照组成纤维细胞单独使用10 nM巴非霉素（左面板）或10 nM巴非霉素加1µM缬霉素（右面板）治疗。在不同的时间点提取蛋白质并进行蛋白质印迹分析。巴非霉素对Mfn2水平没有影响，也没有检测到泛素化。当巴非霉素和缬氨酸霉素结合时，Mfn2泛素化由缬氨酸霉素启动，而不受巴非霉素的影响。在这两个实验中，线粒体标记VDAC1没有改变。β-actin作为负荷控制。Mfn2–丝裂原融合蛋白2；Ub-Mfn2——泛素化丝裂原融合蛋白2；VDAC1–电压依赖性阴离子通道1。
图7
图7。MG132促进Mfn1和Mfn2的去泛素化。
对照组成纤维细胞用1µM缬霉素处理。6小时后，向细胞中添加MG132（最终浓度10µM）。在不同的时间点提取蛋白质并进行蛋白质印迹分析。暴露于（A）UPS抑制剂，即MG132，但不单独暴露于（B）DMSO，会诱导Mfn1和Mfn2的氘化。Mfn1–丝裂原融合蛋白1；Mfn2–丝裂原融合蛋白2；VDAC1–电压依赖性阴离子通道1。
图8
图8。暴露于H2O（运行）2导致Mfn2泛素化。
对照组成纤维细胞在基础条件下培养，用1µM缬霉素处理6小时或用100µM h2O（运行）212小时后，收集细胞，并通过Western blotting分析线粒体和细胞溶质部分。（A） 测定了Mfn2和Parkin的亚细胞定位。使用VDAC1和β-肌动蛋白抗体确认细胞分离的质量。（B） Western blot结果的密度分析显示，安定霉素或H2O（运行）2治疗。（C） 此外，这两种治疗都导致细胞溶质部分Parkin蛋白水平显著下降（根据β-肌动蛋白表达标准化）。（A，右图）蛋白质印迹的较长暴露时间显示两种处理后Parkin的线粒体易位。为了定量蛋白质水平，对三个独立实验的印迹进行了评估。图中给出了平均强度+/-标准偏差。Cyt–细胞溶质部分；H（H）2O（运行）2–过氧化氢；线粒体部分；Mfn2–丝裂原融合蛋白2；Ub-Mfn2——泛素化丝裂原融合蛋白2；缬氨酸-缬氨酸霉素；VDAC1–电压相关阴离子通道1。
图9
图9。线粒体网络的分支。
线粒体形状因子是在一个纯合子对照组中测定的粉红色1和纯合子帕金突变体。量化结果显示，在基础条件下（浅灰色条），突变细胞和对照细胞之间的线粒体分支没有差异。用1µM缬霉素治疗12小时后，所有个体的分枝都减少了，对照组受影响最严重（深灰色条）。在图中，给出了平均形状因子+/-标准偏差。
图10
图10。UPS处Mfn1/2氘化和降解的可能情况。
在缬氨霉素胁迫下，米托福星被Parkin泛素化。多-泛素化的米托福辛随后被26S蛋白酶体19S颗粒的内在泛素结合活性识别。在19S调节复合体中，泛素链被分解，底物在进入20S亚基的空腔之前展开，在那里发生蛋白质水解。同时使用环氧霉素（或MG132）处理可抑制20S核心粒子的降解功能，但不会影响19S亚基的氘化酶活性。因此，多泛素化的线粒体在蛋白酶体中被重泛素化，但不能被降解。Mfn1/2–丝裂原1/2；Ub——泛素；UPS–泛素蛋白酶体系统。
图11
图11。总结PINK1和Parkin在有丝分裂中的假定功能的方案。
通过裂变，线粒体被随机分割。例如，受损的线粒体可以通过膜电位的差异与功能性线粒体区分开来。PINK1检测到膜电位较低的功能失调线粒体，并招募Parkin。其次，Parkin泛素化物Mfn1/2定位于线粒体外膜。随后，泛素化的线粒体被不间断电源降解，防止功能失调的线粒体与功能性线粒体融合。通过这一点，功能失常的线粒体从线粒体的总库中被挑选出来，随后进行有丝分裂。Δψ–线粒体膜电位；Mfn1/2–丝裂原1/2；PINK1–PTEN诱导的假定激酶1；Ub-Mfn1/2——泛素化丝裂原1/2；UPS–泛素蛋白酶体系统。
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