Rudimentary G-quadruplex-based telomere capping in Saccharomyces cerevisiae

doi:10.1038/nsmb.2033

.2011年4月；18（4）:478-85。

doi:10.1038/nsmb.2033。 Epub 2011年3月13日。

酿酒酵母中基于G-四链体的端粒覆盖

茉莉·S·史密斯¹, 陈启军（Qijun Chen）, Liliya A Yatsunyk女士, 约翰·尼科鲁迪斯, 马克·S·加西亚, 拉蒙·克拉纳斯特, Shankar Balasubramanian阶, 大卫·蒙乔德, Marie-Paule Teulade-Fichou公司, 劳拉·阿布拉莫维茨, 大卫·C·舒尔茨, F布拉德·约翰逊

附属公司

PMID： 21399640
预防性维修识别码：项目经理3119813
内政部： 2038年10月10日/nsmb.2033

酿酒酵母中基于G-四链体的初步端粒封端

茉莉·S·史密斯等。自然结构分子生物学. 2011年4月.

.2011年4月；18(4):478-85.

doi:10.1038/nsmb.2033。 Epub 2011年3月13日。

作者

茉莉·S·史密斯¹, 陈启军（Qijun Chen）, Liliya A Yatsunyk女士, 约翰·尼科卢迪斯, 马克·S·加西亚, 拉蒙·克拉纳斯特, Shankar Balasubramanian阶, 大卫·蒙乔德, Marie-Paule Teulade-Fichou公司, 劳拉·阿布拉莫维茨, 大卫·C·舒尔茨, F布拉德·约翰逊

附属

¹宾夕法尼亚大学医学院病理学和实验医学系，美国宾夕法尼亚州费城。

PMID： 21399640
预防性维修识别码：项目经理3119813
内政部： 2038年10月10日/nsmb.2033

摘要

端粒封顶可以从核酸外切酶和检查点中隐藏染色体末端，但封顶机制的完整范围尚未明确。端粒具有形成G-四链体（G4）DNA的潜力，尽管端粒G4 DNA在体内的功能证据有限。在芽殖酵母中，加盖需要Cdc13蛋白，并且在Cdc13-1突变体的非允许温度下会丢失。这里，我们使用几个独立的G4 DNA稳定处理来抑制cdc13-1覆盖缺陷。这包括三种不同的G4 DNA结合蛋白的过度表达，G4 DNA解旋酶Sgs1的丢失，或小分子G4 DNA配体的治疗。在体外，我们发现位于3’悬垂处的蛋白结合G4 DNA抑制5’→用核酸外切酶I切除配对链。这些发现表明，至少在没有完全自然覆盖的情况下，G4 DNA可以在体内端粒发挥积极作用。

PubMed免责声明

数字

图1
G4 DNA结合蛋白Stm1的过度表达可挽救端粒开盖引起的生长缺陷，并且与*RAD52型*-依赖性同源重组。(一)的增长*cdc13-1型*在允许温度（PT，22°C）或半允许温度（SPT，30°C）下携带pSTM1或载体的突变体。(b条)pSTM1过度表达可挽救端粒开盖导致的生长受损*序列号1-154*SPT突变体。(**c（c）**)的增长*cdc13-1 rad52Δ*携带pSTM1或载体的突变体。在每次试验中，在选择性培养基上发现细胞的系列稀释液，并培养3天(**b、 c（c）**)或4天(一). (d日)上图：典型端粒图，包含两个串联的亚端粒Y’元素，由间质端粒重复序列分隔。底部：在SPT液体培养中培养2天的样品的端粒Southern印迹显示端粒酶失活的I型和II型幸存者，以进行比较。内部Y’碎片的大小不同是由于Y’的长短形式。1-5车道和6-9车道是同一Southern blot的路段。

图2
另外两种不同的G4 DNA结合蛋白的表达拯救了*cdc13-1型*温度敏感性表型。(一)在GAL1启动子（pRQC）或载体控制下，从质粒过度表达的G4 DNA-结合Sgs1 RQC结构域被转化到指定的菌株背景中，并在斑点分析中进行测试。(b条)5×HA标记的Sgs1 RQC结构域富集于*cdc13-1型*突变体。所用的引物集直接邻近端粒（亚端粒Y’重复序列）或对照、着丝粒近端引物集（部分*SWC4软件*，没有QFP）。端粒/着丝粒比率列在条形图上方。误差线为±1 s.d.，在三个独立的ChIP实验中获得了基本相同的结果。模拟IP表明*cdc13-1 sgs1Δ*含有RQC表达载体的细胞在无抗体的情况下进行ChIP。(**c（c）**)GAL诱导G4 DNA结合单链抗体（scFv）、HF1或空载体的过度表达*cdc13-1型*突变体。在每次试验中，在含有2%半乳糖的选择性培养基上发现细胞的系列稀释液，并在指定的温度下培养4天(d日)13xMyc标记的HF1单链抗体在*cdc13-1型*突变体。DNA扩增如(b条). 误差线为±1 s.d.，在三个独立的ChIP实验中获得了基本相同的结果。

图3
损失*SGS1型*与G4 DNA结合和解救相关的活动*cdc13-1型*温度灵敏度，与*RAD52型*-依赖性同源重组。(一)的增长*cdc13-1 rad24Δrad52Δ*，或者*SGS1型*或*sgs1Δ*，在允许温度和SPT下。(b条)本研究中突变或缺失的特定Sgs1结构域的图谱。(**c（c）**)仅删除G-四链体结合RQC结构域就足以挽救*cdc13-1型*生长缺陷。(d日)Sgs1解旋酶活性丧失（K706A点突变，表示*sgs1-hd公司*)足以进行救援*cdc13-1型*温度敏感性。(**e（电子）**)Sgs1是Sgs1–Top3–Rmi1综合体的唯一组成部分，当它丢失时，足以拯救*cdc13-1型*温度敏感性表型。在每次试验中，在YPAD上发现细胞的系列稀释液(**a、 e（电子）**)或选择性介质(**c、天**)并在指定温度下生长3d(**a、 c、d**)或4天(**e（电子）**).

图4
NPT（37°C）处的端粒近端单链（ss）DNA积累被两种G4 DNA稳定机制减弱。(**a、 b条**)ssDNA测量*STM1型*过度表达(一)或*sgs1号机组*删除(b条)英寸*cdc13-1 rad24Δrad52Δ*背景。用一个互补的末端标记ssDNA探针针对Y’元素探测亚端基G链ssDNA，并通过归一化天然到变性样品的杂交信号进行量化。每个样品一式三份，并显示标准误差。每个图表都是一个有代表性的实验。实验之间ssDNA积累时间的明显差异反映了检测的时间点，而不是真实的实验可变性。(**c、天**)Stm1过度表达或*sgs1型*在中删除*cdc13-1 rad24Δrad52Δ*细胞在NPT（37°C）下培养。用0.033%甲基磺酸甲酯（MMS）处理野生型细胞可对Rad53磷酸化进行积极控制(**第4天**，车道1）。

图5
救援行动减弱*cdc13-1型*SPT的增长*sgs1号机组*具有降低端粒处QFP的突变端粒酶RNA模板的细胞中的缺失。(一)*cdc13-1 rad24Δrad52Δtlc1Δ*单元格，或者*SGS1型*或*sgs1Δ*和质粒携带野生型*薄层色谱法1*或者uCu或CuA突变体*薄层色谱法*在SC-HIS培养基上发现等位基因，并培养4d薄层色谱法1模板，包括突变区域（粗体）如下：3′-CACACACCCA公司CACAC-5′。(b条)代表性的CD光谱*薄层色谱法*突变的端粒序列及其校正的对应物（见表1）。(**c（c）**)突变序列与校正序列的热差异光谱（TDS），显示为摩尔消光系数之间的差异。G4 DNA在295 nm处出现负峰，在273 nm和242 nm处出现正峰。所有四个校正的序列都显示了通过CD（平行四联体用于1-corr，混合平行和反平行用于2，3和4-corr）和TDS形成G4 DNA的证据。(d日)寡核苷酸的热变性后，在263 nm处（对于寡核苷酸1、1-校正（corr）、2和2-corr）或290 nm处（针对寡核苷酸3、3-校正、4和4-corr）进行CD吸光度测定。

图6
G4 DNA结合蛋白和G4 DNA形成序列协同抑制Exo1的末端切除*在体外*. (一)具有形成（底部）或不形成（顶部）G-四链体DNA的3′外伸的合成底物。每个都含有51 bp相同的双链DNA。每个顶链的5′端被生物素化（B）以阻止从错误端切除，每个底链的末端基底被标记为α-³²P-dCTP公司。我们展示了一个平行的分子内四链体（底部），尽管这可能不是这个悬挑形成的实际或唯一的结构。(b条)CD对悬置底物的分析显示，在Exo1分析所用的确切条件下，平行和反平行G4 DNA（GGG悬置）和可能的GA同源双链（GAG悬置，见图6）的混合物。(**c（c）**)GGG和GAG的热差谱仅对GGG悬挑产生G-四重特异性信号。(**d、 e（电子）**)两个Stm1(d日)和HF1(**e（电子）**)配合G4 DNA悬挑部分拯救Exo1 5′→3′切除。剩余全长序列分数的量化；显示了两个值的平均值(d日)或三个(**e（电子）**)使用标准误差和*P（P）*-未配对双尾学生的值t吨-测试。(**（f）**)T4基因32蛋白（T4g32p）保护作用的量化。显示了两个实验的平均值。*P（P）*>所有浓度的T4g32p均为0.7。

图7
端粒帽盖模型，其中G4 DNA与G-四链体结合蛋白（G4BP）协同抑制由Cdc13功能丧失引起的外核降解和检查点激活。

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