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.2011年3月9日；31(10):3565-79.
doi:10.1523/JNEUROSCI.6041-10.2011。

功能性NMDA受体异源四聚体组装需要分离结构域接触

安东尼·法里纳 1, 凯瑟琳·布莱恩, Tomohiko Maruo先生, 维泰克·奎亚特科夫斯基（Witek Kwiatkowski）, 塞尼恩·崔, 中川泰隆（Terunaga Nakagawa）
附属公司

功能性NMDA受体异源四聚体组装需要分离结构域接触

安东尼·法里纳等。 神经科学. .

摘要

准确了解NMDA受体（NMDA-Rs）的亚单位组装过程对于理解受体结构和通道功能的潜在机制至关重要。由于NMDA-Rs是必需的异源四聚体，需要GluN1亚单位，因此研究GluN1和GluN2型亚单位如何结合成四聚体至关重要。通过结合细胞生物学、生物化学、单粒子电子显微镜和x射线结晶学的方法，我们报道了受体成熟缺陷的突变GluN1亚单位的机制和表型。GluN1的N末端结构域（NTD）中的T110A突变促进GluN1和GluN2的NTD之间的异二聚体，而相邻残基中的Y109C突变稳定了GluN1 NTD的同二聚体。GluN1的NTD的晶体结构揭示了这些突变体生化特性的机制。使用受体贩运试验研究这些突变对异聚NMDA-Rs成熟的影响。我们的结果表明，GluN1亚单位的NTD最初形成同型二聚体，随后的二聚体解离对于形成包含GluN2亚单位的异四聚NMDA-Rs至关重要，从而定义了受体组装的分子决定簇。GluN1二聚体NTD的结构域排列在离子型谷氨酸受体中是独特的，并预测NMDA-Rs NTD周围的结构和机制与同源AMPA和红藻氨酸受体不同。

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数字

图1。
图1。
GluN1的NTD与GluN2的NTD相互作用。A类、全长NMDA-R的结构域组织。显示了N末端结构域、配体结合结构域、跨膜结构域（表示M1、M2、M3和M4跨膜螺旋）和C末端结构域。B类，HEK-TetON细胞与pTRE紧密衍生质粒共转染的图像，该质粒表达每列顶部所示的蛋白质。“D类“表明这两个蛋白是使用双表达质粒表达的。不表达任何蛋白的空质粒显示为“模拟”。EGFP表达质粒用作左栏中的模拟质粒。顶行，差分干涉对比度（DIC）图像。中行，与DIC图像相同区域的表面染色。用抗-FLAG抗体检测FLAG-GluN2A。最下面一行，合并的总染色显示有效的共表达，与表面染色分开进行。插图，代表性放大图像。比例尺，200μm。C类，表面标记GluN2A的定量B类.N.D.，未确定，因为没有信号。样本大小，n个=100个细胞。D类，HEK-TetON细胞仅表达GluN1-NTD-HA（顶行）或与GluN2B-NTD-FLAG（底行）的免疫荧光图像。绿色，GluN2B；红色，GluN1-NTD。pTREThight载体用于表达NTD。比例尺，10μm。E类，表达GluN1和GluN2亚基NTD的GnTI（−）HEK细胞的总细胞裂解物（total）和培养上清液（培养基）的蛋白质印迹，如每行左侧所示。指示用于探针的抗体（αHA和αFLAG）。F类与表达GluN1和GluN2亚单位NTD的质粒共转染的GnTI（−）HEK细胞的总细胞裂解物（total）和培养上清液（Media）的Western blot，如每行左侧所示。G公司Western blot显示GluN2A（或2B）-NTD-HA与GluN1-NTD-FLAG的共免疫沉淀（Co-IP）。使用抗FLAG抗体（IP:αFLAG）进行Co-IP。显示了输入、流量（FT）和洗脱级分。
图2。
图2。
T110A突变促进GluN1和GluN2的NTD异源二聚体化。A类在GnTI（−）HEK细胞中，HA标记的wt或突变体（T110A）GluN1-NTD与GluN2A-NTD-FLAG共表达。使用抗FLAG抗体对分泌的蛋白质进行免疫沉淀。输入（I）和洗脱（E）分数显示在Western blots中。指示用于探针的抗体（αHA和αFLAG）。B类，实验类似于A类，但使用GluN2B-NTD代替GluN2A-NTD。C类，洗脱与输入的比率A类和B类在直方图中进行量化和总结。蓝色，GluN2A-NTD；红色，GluN2B-NTD。星号（*）表示第页< 0.05,n个=3。注意，当引入T110A突变时，GluN1和GluN2的NTD之间的关联增加。D类GluN2B-NTD-8His和GluN1-NTD（T110A）-HA在GnTI（−）HEK细胞中共表达，并使用His标签纯化分泌蛋白。实线显示了纯化蛋白质的代表性凝胶过滤色谱仪。虚线是纯化GluN1-NTD（T110A）-8His的色谱仪。箭头表示异二聚体和单体的洗脱体积。峰组分的蛋白质印迹显示在右侧（每个组分的洗脱体积范围显示在分数上方）。指示用于探针的抗体（αHA和αHis）。E类，HEK-TetON细胞与pTRE紧密衍生质粒共转染的图像，该质粒表达每列顶部所示的蛋白质。“D类“表明这两个蛋白是使用双表达质粒表达的。没有插入物的空质粒用作阴性对照（Mock）。顶行，差分干涉对比度（DIC）图像。第二行，使用检测细胞表面全长FLAG-GluN2A的抗FLAG抗体对相同区域进行表面染色。最下面一行，合并的总染色显示有效的共表达，与表面染色分开进行。插图是具有代表性的放大图像。比例尺，200μm。F类，直方图总结了表面标记的GluN2A在E类. ***第页< 0.001; 未确定，因为没有信号。样本大小，n个=100个单元格。
图3。
图3。
NTD的单粒子电子显微镜。A类，GluA1-NTD的原始粒子图像（左上）和15个代表类平均值（右上）。底部图像是GluA1 NTD的三个代表性类平均值（左下），其取向类似于从大鼠脑中纯化的天然四聚体AMPA-R的NTD（右下）。比例尺，100Å.B类，直方图表示下面定义的类别中的粒子数。根据GluA1-NTD（蛋白质数据库标识符3H5V；直方图底部）晶体结构的四个不同方向（标记为I–IV）填充定义尺寸的方框的能力，分析了GluA1-NTD的类别平均值。无法明确指定类别的粒子被指示为不可分类（NC）。一、 100×95Å 盒子；二、 100×60Å; 三、 60×60Å 盒子；和IV，60×75Å. 比例尺，100Å.C类，GluN2B-NTD的原始粒子图像（左）显示了15个代表性类别平均值（右）。比例尺，100Å.D类，GluN1-NTD的原始粒子图像（左）显示了15个代表性类别平均值（右）。箭头表示类平均值中的较大粒子。比例尺，100Å.E类，直方图总结了具有水平轴中指示的像素区域的粒子数。分析GluA1（顶部）、GluN2B（中部）和GluN1（底部）的NTD。注意GluN1-NTD颗粒中的额外峰值（箭头所示）。分析的总颗粒如下：GluA1 NTD，n个= 7964; GluN1-NTD，n个= 5088; 和GluN2B-NTD，n个=7565。
图4。
图4。
GluN1-NTD原单体的晶体结构。A类，从两个角度观察GluN1 NTD的单个原聚体。R1（橙色）和R2（黄色）子域用箭头表示。左下角显示了子域的蛤壳状排列图。灰色原子代表五个可识别的原子N个-连接的糖基化（残基N61、N203、N239、N276和N300处）。B类，GluN2B-NTD（蛋白质数据库标识符3JPW）显示在与GluN1-NTD相同的观察方向A类（右）。品红，R1；浅蓝色，R2。星号(A类，右）表示GluN1-NTD的R1子域中的α螺旋1（α1），该子域是GluN2B-NTD中的有序线圈（星号和蓝色线圈）。C类，锌结合GluN2B-NTD（蛋白质数据库标识符3JPY，右）中ifenprodil结合囊（I）或锌结合囊（Z）的空腔和GluN1-NTD中的相应区域（左，分别表示为I和Z）以红色空格填充。两个NTD以相同的视角显示。口袋的局部化学环境由彩色编码氨基酸残基显示（红色、天冬氨酸和谷氨酸；蓝色、赖氨酸、精氨酸和组氨酸；浅绿色疏水性和芳香性、苯丙氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、伊利酸、亮氨酸）。在C类和D类用于表示每个NTD的R1和R2域的颜色代码也应用于底部的图表中。D类，GluN1-NTD与GluN2B-NTD具有相同的扭曲构象。底部显示的NTD在对齐R1子域后叠加。“扭曲”构象由GluN1-NTD（Pro143；黑色球体）的旋转关键点到每个原聚体R2结构域中β7末端之间的角度定义。与GluN1-NTD相比，GluA2和GluK2的NTD的R2子域围绕枢轴点旋转45°（箭头）。
图5。
图5。
GluN1-NTD二聚体及其同源物的结构和结构域组织。A类，GluN1-NTD从三个不同方向观察。二聚体的全局双旋转轴在俯视图（左侧）中显示为一个点，在侧视图中显示为虚线（中部和右侧）。橙色R1和黄色R2子域形成原聚体，而红色R1和粉红色R2子域则形成另一个（也如右图所示）。注意R2部分（黄色和粉红色）是分离的，不参与二聚体界面。B类，GluA2-NTD二聚体（蛋白质数据库标识符3H5V）如A类.全局双旋转轴如所示A类.浅绿色R1和深绿色R2子域形成原聚体，而浅蓝色R1和深蓝R2子域则形成另一个原聚体（也如右图所示）。C类，mGluR1 LBD（Apo状态）二聚体被视为A类和B类（蛋白质数据库标识符1EWT）。去除氨基酸344-407和51-73，以更好地观察二聚体界面。全局双旋转轴如所示A类深灰色R1和浅灰色R2亚结构域形成原聚体，而浅棕色R1和深棕色R2亚结构区形成另一个原聚体（也如右图所示）。
图6。
图6。
GluN1-NTD二聚体的二聚体界面。A类，形成二聚体的GluN1-NTD的两个原聚体的表面表征。着色表面表示掩埋的二聚体界面中的残基。红色和橙色代表界面内的残留物，这些残留物会产生特定的侧链相互作用。剩余触点表示为连接线。实心黑线表示疏水性侧链相互作用，而虚线表示极性或离子相互作用。红色（Y109）和绿色（T110）代表本研究中突变的残基。二聚体界面处GluN1-NTD的总埋表面积为～1000Å2，与mGluR1-LBD（～900）相当Å2)（Kunishima等人，2000年），但没有GluK2（Kumar等人，2009年）和GluA2-NTD（Jin等人，2009）大（～1500Å2)其二聚体界面均匀分布在R1和R2结构域之间。B类，GluN1-NTD、GluA2-NTD（蛋白质数据库标识符3H5V）和mGluR1-LBD（蛋白质数据数据库标识符1EWT）的二聚体结构在对齐每个结构的一个R1子域后显示。箭头表示对齐的R1子域。每个NTD的R1和R2子域都进行了彩色编码，如图5所示。螺旋α2和α3被标记。注意，R2结构域的相对取向在每个NTD二聚体中是唯一的。因此，R1亚结构域在每个NTD二聚体中的全局定位高度不同。
图7。
图7。
Y109C突变通过形成分子间二硫键来稳定GluN1-NTD二聚体。A类，从二聚体（左侧）底部（LBD所在的一侧）观察GluN1-NTD的图示。以α螺旋2和3为中心的GluN1-NTD二聚体界面放大（右）。残留物Y109和N70表示为球体。B类，GluN1-NTD Y109C（实线红线）和野生型GluN1-NTD（虚线蓝线）的代表性凝胶过滤色谱仪。单体和二聚体峰用箭头表示。C类wt和突变GluN1-NTD（N70C和Y109C）的Western blots。SDS-PAGE在还原[（+）DTT）]或非还原[（-）DTT]条件下进行。左下面板是还原SDS-PAGE后每个蛋白质的总细胞裂解物的Western blot。绿色和蓝色箭头分别表示GluN1-NTD同型二聚体和GluN1-NTD单体的流动性。以抗-HA（α-HA）抗体为探针。D类，GluN1-NTD-Y109C二聚体的原始粒子EM图像。E类，GluN1-NTD-Y109C的代表类平均值。每行中的投影结构与右端所示的晶体结构视图一致。D类,E类，比例尺，100Å.F类，柱状图，其总结了具有在横轴中指示的像素面积的GluN1-NTD-Y109C颗粒的数量。箭头指示野生型GluN1-NTD颗粒中峰值的位置（与图3底部直方图中所示的箭头相同E类). 分析的总颗粒为n个= 5166.
图8。
图8。
Y109C突变对异四聚体NMDA-Rs组装的影响。A类HEK-TetON细胞总裂解物的Western blots。每个样品在还原[（+）DTT和非还原（-）DTT]条件下通过SDS-PAGE进行解析。左对，单个表达GluN1变体的细胞的总裂解物[wt或突变体（Y109C和N70C）]。右对，来自双重表达GluN1变体和野生型GluN2B的细胞的总裂解物。在A类——D类，每个蛋白质印迹中使用的抗体显示在每个面板的底部。在A类,B类、和D类，黑色填充箭头和开放箭头分别表示GluN1同型二聚体和单体的位置。灰色箭头表示GluN2B单体的位置。B类，由GluN2B和GluN1变异体组成的复合物的蛋白质印迹[wt或突变体（Y109C和N70C）]。如上所述，SDS-PAGE是在还原和非还原条件下进行的。使用双重表达质粒表达GluN1变体和GluN2，并使用识别GluN2B亚单位的FLAG标签的抗FLAG抗体免疫沉淀复合物。C类GnTI（−）HEK细胞培养上清液（培养基）与表达GluN1-NTD-Y109C的固定数量质粒共转染，表达GluN2B-NTD-FLAG的质粒数量增加（用填充三角形表示）。在每种条件下，通过向DNA数量补充一个空质粒，使总转染质粒相等。如上所述，SDS-PAGE是在还原和非还原条件下进行的。左下面板（Total）是还原SDS-PAGE后每个蛋白质的总细胞裂解物的Western blot。黑色填充箭头和开放箭头分别表示GluN1-NTD二聚体和单体的位置。分别用抗-HA和抗FLAG抗体检测GluN1-NTD和GluN2B-NTD。D类、与表达GluN1–Y109C的固定数量质粒和表达FLAG-GluN2B的增加数量质粒共同转染的HEK-TetON细胞的总细胞裂解物的Western blot（由填充的黑色三角形表示）。在每种条件下，通过向DNA数量补充一个空质粒，使总转染质粒相等。如上所述，SDS-PAGE是在还原和非还原条件下进行的。单体和二聚体的位置用箭头表示，如A类和B类.
图9。
图9。
GluN1的Y109C突变对受体成熟的影响。A类，HEK-TetON细胞与质粒共转染的图像，质粒表达每列顶部指示的蛋白质。“D类“表明这两个蛋白是使用双表达质粒表达的。在左列中使用没有插入物的空质粒作为阴性对照（Mock）。顶行，差分对比度干扰（DIC）图像。第二行，使用检测细胞表面全长FLAG-GluN2A的抗FLAG抗体对相同区域进行表面染色。最下面一行，合并的总染色显示有效的共表达，与表面染色一样作为单独的实验进行。插图是从同一区域拍摄的具有代表性的放大图像。比例尺，200μm。B类，一个直方图，总结了细胞表面GluN2A信号在A类. ***第页< 0.001; N.D，未确定，因为没有信号。样本大小，n个=100个单元格。
图10。
图10。
异四聚体NMDA-Rs组装途径的模型。A类，GluN1-NTD二聚体界面处Y109和T110之间的侧链相互作用。虚线表示T110和Y109之间的氢键。B类，描述异四聚体NMDA-Rs组装期间NTD重排的模型。左，GluN1-NTD的二聚体和GluN2-NTDs的两个单体。对，推测成熟NMDA-R中NTD的异四聚体。GluN1-NTD的初始同二聚体对于GluN2-NTD的补充至关重要。GluN1-NTD同型二聚体随后破裂有助于四聚体的形成。红线表示GluN1-NTD的同二聚体界面。黄线表示参与畴间接触的GluN2-NTD的相应表面。C类，描述异四聚体NMDA-R的亚基组装路径的模型。左，二聚体GluN1和GluN2的两个单体。右，异四聚体NMDA-R。每个亚单位由NTD（绿色和品红色）、LBD（灰色和棕色）和TMD（黄色和浅蓝色）的球状结构域表示。域也位于背景中所示的“层”中。GluN1的同型二聚体最初形成，并用作招募GluN2s的支架。NTD之间域间接触的切换对受体组装至关重要。根据Furukawa等人（2005），LBD形成一对异二聚体。箭头表示四聚期间NTD和LBD之间的畴间相互作用。D类，GluN1-NTD二聚体和提议的LBD异四聚体之间的几何形状比较（Sobolevsky等人，2009年）。顶部，从LBD侧观察GluN1-NTD二聚体。黑色球体是每个NTD的C端。底部，LBD的异四聚体由GluN1和GluN2A组成，从NTD侧观察。黑色球体是每个LBD的N端。绘制平行实线和虚线以指示两个结构的对齐。将显示点之间的距离。E类中的GluN1-NTD和GluN1-1LBDD类放置在一起，以便NTD的C端和LBD的N端非常接近。显示了两个不同的视图。NTD的最近C端子和LBD的N端子之间的距离为16Å。
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中的注释

  • 建立和打破界面：受体是如何形成的。
    Chaudhry C、Scimemi A、Kumar J。 Chaudhry C等人。 神经科学杂志。2011年7月27日；31（30）：10749-51。doi:10.1523/JNEUROSCI.2312-11.2011。 神经科学杂志。2011 PMID：21795526 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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