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.2011年2月15日；9（2）：e1000593。
doi:10.1371/journal.pbio.1000593。

SNW1是脊椎动物胚胎中空间BMP活性、神经板边界形成和神经嵴规格的关键调节器

吴玛丽 1, 玛丽·克里斯汀·拉梅尔, 迈克尔·豪厄尔, 卡罗琳·S·希尔
附属公司

SNW1是脊椎动物胚胎中空间BMP活性、神经板边界形成和神经嵴规格的关键调节器

玛丽·Y·吴等。 公共科学图书馆生物. .

摘要

骨形态发生蛋白（BMP）梯度提供位置信息，以指导细胞命运规范，例如脊椎动物外胚层形成神经、神经嵴和表皮组织的模式，精确的边界将这些结构域分离。然而，关于BMP活性在脊椎动物发育过程中如何在空间和时间上进行调节以促进胚胎模式形成，更具体地说，是如何促进神经嵴形成的，我们知之甚少。通过对爪蟾神经嵴命运的大规模体内功能筛选，我们确定了BMP活性的一个重要调节因子SNW1。SNW1是一种已知的调节基因表达的核蛋白。通过使用反义吗啉来去除爪蟾和斑马鱼胚胎中的SNW1蛋白，我们证明了神经嵴规范需要背向表达的SNW1.这与中胚层形成和原肠胚形态发生运动无关。通过对非洲爪蟾胚胎中磷酸化Smad1的免疫染色和一个BMP依赖性报告基因转基因斑马鱼系的联合应用，我们表明，SNW1在原肠胚后阶段调节神经板边缘的背外胚层中的一个特定BMP活性域。我们使用双原位杂交和免疫荧光来显示BMP活性域相对于神经嵴域和SNW1表达域的空间位置。进一步使用细胞培养和组织外植体进行体内和体外实验，我们可以得出结论，SNW1作用于BMP受体的上游。最后，我们证明了SNW1对神经嵴规范的要求是通过其调节BMP活性的能力，因为我们证明了BMP在神经板边界的靶向过度表达足以恢复爪蟾SNW1变体中的神经嵴形成。我们得出的结论是，通过其调节脊椎动物胚胎中BMP活性的特定结构域的能力，SNW1是神经板边界形成的关键调节因子，从而是神经嵴规格的关键调节因子。

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数字

图1
图1。SNW1在神经嵴命运功能筛查中被识别X·莱维斯。
（A） 描述经典模型的第14阶段胚胎图，该模型提出外胚层模式和神经嵴形成需要不同水平的BMP信号。（B） 功能屏幕概述。（C） 筛选出的蛋白质的过度表达调节了鼻塞表达式。200 pg mRNA表达十、热带c（c）-Myc、Dkk-1、Noggin2、，或序号1在单细胞期注射250 pgGFP公司mRNA作为示踪剂。对照胚胎接受GFP公司仅mRNA。胚胎在第14阶段被固定并分析鼻塞WISH表示。给出了显示染色模式的总分析胚胎数。（D）拉埃维斯X.laevis对胚胎进行分析序号1WISH在指定阶段的表达。（E） 整体X·莱维斯从野生型（WT）胚胎或在单细胞阶段注射20 ng翻译阻断MO（MoSNW1a）的胚胎中制备胚胎提取物，并使用SNW1和Tubulin抗体进行Western blotting分析，后者作为负荷对照。指出了其发展阶段。（F） 斑马鱼胚胎分析SNW1型在指定的时间表达。图中显示了两个原肠胚形成阶段（盾牌阶段和75%外胚层）和三个分段阶段（11、12和13 hpf）。图中显示了侧视图，对于后期，也显示了背前视图。（G） 在受精后的指定时间，从野生型胚胎中制备整个斑马鱼胚胎提取物，并使用SNW1和MCM6抗体进行Western blotting分析，后者作为负荷对照。指出了其发展阶段。E、 未受精的卵。
图2
图2。SNW1敲除抑制神经嵴诱导。
（A） 注射MoSNW1a（图S3）导致神经嵴标记物丢失蜗牛、鼻涕虫、和Sox9指数在第14级注入侧。将MoSNW1a（20 ng）与Fdx作为示踪剂共同注射到双细胞的一个细胞中爪蟾胚胎。使用抗荧光素抗体检测示踪剂。对照胚胎未注射。（B） 双电池爪蟾将胚胎注射到一个细胞中，注入20 ng对照MO（MoControl）或20 ng MoSNW1a。WISH在第28阶段使用探针扭曲.（C）爪蟾胚胎注射对照MO或MoSNW1a，如（B）所示。42岁时，面部软骨用阿尔西安蓝染色，然后解剖。注射侧用箭头表示。（D） 斑马鱼胚胎注射15 ng对照MO或MoZFSNW1，并使用针对神经嵴标记的探针在13 hpf下固定WISHSox10，或在12 hpf条件下对WISH进行探测福克斯D3以及近轴和近轴中胚层标记MyoD公司图中显示了一组胚胎以及一个具有代表性的单个胚胎。神经嵴细胞用灰色箭头标记，MyoD阳性细胞用星号标记（右侧面板）。对于MyoD公司染色后，只有近轴中胚层可见，这不受SNW1缺失的影响。在所有情况下，都给出了显示所呈现染色模式或表型的总分析胚胎数。
图3
图3。Dorsally表达的SNW1是神经嵴规范所必需的，这与中胚层无关。
（A） 左侧面板。对受精后指定时间的野生型（WT）斑马鱼胚胎进行神经嵴标记双重染色Sox10型（深蓝色）和序号1（灰紫色），位于神经板内（见图1F）。右侧面板。野生型阶段14爪蟾胚胎被染色序号1，神经嵴标记鼻塞或神经板标记Sox3系列橙色线条标记神经嵴染色的边缘，以便直接比较表达域。（B） 四细胞的一个背卵裂球或一个腹卵裂球爪蟾如图所示，胚胎注射Fdx（含或不含10 ng MoSNW1a）。在第14阶段，胚胎被染色鼻塞和荧光素。（C）爪蟾胚胎或未注射（对照），在单细胞期注射20 ng MoSNW1a，注射250 pg证书mRNA在四细胞期注入所有四个卵裂球，或在单细胞期注射MoSNW1a，然后证书mRNA在四细胞期表达。对中胚层标记物进行了WISHXbra公司和Gsc公司第12阶段，或神经板标记Sox3系列和神经嵴标记鼻塞第14阶段。OE，过度表达。在所有情况下，都给出了所分析的总胚胎数，显示了所呈现的染色模式。
图4
图4。SNW1对于神经和非神经外胚层之间的边界的规定至关重要。
（A）爪蟾胚胎在单细胞期未注射（对照）或注射20 ng MoSNW1a。对背部中胚层标记物进行WISH古塞科动物(Gsc公司)，背中线标记科尔丁(变更),Xnot公司、和诺金(诺格)，近轴中胚层标记重量8和MyoD公司，神经板标记索克斯3，前部神经标志物其他2前神经和神经板边界标记Zic3公司，表皮标记表皮角蛋白(EpiKer公司)和神经板边界标记骨形态发生蛋白4,Sox9、蜗牛、鼻涕虫、FoxD3、，和Msx1型.箭头表示Xnot公司,诺金，和重量8位于神经前缘。对于EpiKer公司，除了背面视图外，还显示了侧面视图。在所有面板中，前面是顶部。（B） 侧视图和背视图索克斯3显示了意愿。请注意，当SNW1耗尽时，神经板的锐边不会形成。（C） 斑马鱼胚胎注射15 ng的对照MO（MoControl）或MoZFSNW1，并固定在11 hpf下，使用探针进行双原位杂交Sox10型（紫色）和神经板标记N-钙粘蛋白(N-计算机辅助设计; 绿松石）。显示了同一胚胎的侧视图和前视图。（D）爪蟾胚胎要么未注射（对照），要么在一个细胞阶段注射20ng的MoSNW1a。在第14阶段进行了双原位杂交鼻塞（深蓝色）和Sox2系统（绿松石），或EpiKer公司（深蓝色）和Sox2系统（绿松石色）。红线表示神经板和表皮之间的边界。在所有情况下，都给出了所分析的总胚胎数，显示了所呈现的染色模式。
图5
图5。SNW1调节BMP活性爪蟾和斑马鱼胚胎，是神经组织和非神经组织交界处BMP活性的关键。
（A） 一个细胞爪蟾胚胎要么未注射（对照），要么注射20 ng MoSNW1a或500 pg十、热带(X吨)序号1在指定的阶段采集胚胎，并使用抗p-Smad1和Tubulin抗体通过Western blotting分析整个胚胎提取物，后者作为负荷对照。与Tubulin相关的p-Smad1水平的量化如印迹所示。（B）爪蟾胚胎要么未注射（对照），要么注射20 ng MoSNW1a或500 pgX.热带SNW1mRNA在单细胞期表达，在第14期分裂为背侧（D）和腹侧（V）两半。使用抗SNW1、p-Smad1、Smad1和Tubulin的抗体进行全细胞提取物的Western blotting分析，最后一种抗体作为负荷对照。我们，整个胚胎。（C） 斑马鱼胚胎未注射（U）或注射更多（5、10、15或20 ng）的拼接嵌段MO-MoZFSNW1。胚胎在8、10或12 hpf时收获。用抗SNW1、p-Smad1和MCM6抗体对全胚胎提取物进行Western blotting分析，最后一种抗体作为负荷对照。（D） SNW1基因敲除在第13阶段显著降低腹侧p-Smad1水平，但在第10阶段对p-Smadl腹侧/背侧梯度没有影响。在一个细胞阶段未注射（对照）或注射20ng MoSNW1a的胚胎固定在第10阶段或第13阶段，沿中线矢状平分，并用抗p-Smad1的抗体进行免疫染色。对于这些面板和随后的p-Smad1免疫染色，特定的p-Smad1染色是核染色和点状染色。A、 前部；D、 背侧；P、 后部；五、 腹部。（E） 转基因BRE-mRFP公司胚胎注射15 ng对照MO或MoZFSNW1。当进行WISH时，它们被固定在11、12和13 hpfmRFP公司，其指示BMP活性的结构域。在每种情况下，同一胚胎的三个不同视图都会显示出来。在对照胚胎中，mRFP公司表达于尾芽（见背后视图）和11hpf（红色箭头）处的前背部马蹄形区域，在12hpf和13hpf时变得越来越尖锐。在序号1变形体mRFP公司此背前区减少或缺失。然而，mRFP公司骨形态发生蛋白在后部的表达以及BMP活性仅略有降低或不变。在（D）和（E）中，给出了显示所示染色模式的总分析胚胎数。在（E）中，MO仅从8 hpf开始击倒SNW1，因此其影响仅在10 hpf后才变得明显。这解释了为什么只有一小部分11hpf的胚胎表现出这种表型。到13 hpf时，当MO有效地击倒SNW1时，66%的胚胎显示出表型。
图6
图6。原肠后斑马鱼和爪蟾胚胎神经嵴区与BMP活性的背前区重叠。
（A） 在斑马鱼发育的早期分段阶段序号1和Sox10型部分与BMP活性的前“马蹄形”结构域重叠。转基因BRE-mRFP公司斑马鱼胚胎染色序号1（灰紫色）和Sox10型（深蓝色），Sox10型（深蓝色）和mRFP公司（灰紫色），mRFP公司（深蓝色）和SNW1型（绿松石色），mRFP公司（深蓝色）和血红蛋白1（褐红色），或序号1（深蓝色）和血红蛋白1（栗色）在11小时和13小时。mRFP公司染色显示BMP活性区域。（B） 图中显示了四个标记的染色模式。在11 hpf时SNW1、Sox10、，和mRFP公司部分重叠于马蹄前区背侧边缘。然而，在13 hpf时，很明显，尽管神经嵴标志物Sox10型仍然与的域相邻序号1在神经板、马蹄铁中的表达mRFP公司表达式域（[A]中的红色箭头）与Sox10型和序号1表达域。（C） 野生型阶段13爪蟾胚胎通过神经嵴区横切。前半部分用针对p-Smad1的抗体进行免疫染色，后半部分用于针对鼻塞然后沿着对分平面对胚胎进行成像并进行叠加。黄色线条勾勒出神经板边缘检测到的p-Smad1染色的边界，该边界与鼻塞-阳性神经嵴细胞。
图7
图7。SNW1在组织培养细胞或爪蟾动物帽外植体。
（A） SNW1的敲除对配体刺激反应中的p-Smad1/5或p-Smad2水平没有影响。SNW1在MDA-MB-231细胞中使用含有四种特异性靶向人类的单个双链体的siRNA库被耗尽序号1mRNA。siRNA转染72小时后，细胞未被诱导或用20 ng/ml BMP4（R&D系统）或2 ng/ml TGF-β（PeproTech）诱导1小时。使用抗SNW1、p-Smad1/5、p-Smad2和Smad2/3的抗体进行全细胞提取物的Western blotting分析，最后一种抗体用作负荷对照。在该凝胶体系中，p-Smad1和p-Smad5被分解成两条带。RiscFree（RF）siRNA是一种用作对照的非靶向双链。（B） siRNA-介导的哺乳动物细胞中SNW1的敲除并不影响BMP反应报告活性。用非靶向siRNA（NT）转染稳定表达TK-Renilla和BRE-荧光素酶的MDA-MB-231细胞系，该siRNA池针对序号1，组成池的四个单独的siRNA，或针对Smad4公司转染后72 h，用200 ng/ml BMP7（PeproTech）诱导细胞。1小时后采集样本进行Western印迹，8小时后进行荧光素酶/Renilla分析。Western blot显示了敲除的效率。（C） SNW1缺失仅影响整个胚胎中的BMP活性，而不影响动物帽中BMP活性。胚胎未注射或在单细胞阶段注射20 ng MoSNW1a或10 pg表达Noggin的质粒。在第8.5阶段切割动物帽并培养，直到同胞胚胎达到第14阶段。使用抗p-Smad1、Smad1，SNW1和Tubulin抗体（最后一种作为负荷对照），通过Western blotting分析整个胚胎或动物帽的全细胞提取物。
图8
图8。背部外胚层中Noggin的表达减少了BMP信号传导，模拟了SNW1缺失，而BMP2b的过度表达可以缓解SNW1缺乏的影响。
（A–C）未注射胚胎，在单细胞期注射20 ng MoSNW1a，或注射5 pg Noggin表达质粒和100 pgGFP公司mRNA作为16细胞期背侧a层卵裂球的示踪剂。样品固定在第13阶段，用于p-Smad1（[A]，伪彩色品红色）的免疫染色。在第14阶段使用抗p-Smad1和Tubulin的抗体采集样本进行Western blot分析，后者用作负荷控制（B），并在14阶段使用针对鼻塞和Sox2系统第28阶段进行表型分析（C）。在（A）中，细胞核用DAPI（假彩色青色）和Noggin注射GFP的细胞进行可视化。背侧（D）有标记。在（B）中，两条不相关的车道已被移除，如间隙所示。在（C）的右下角，GFP标记了胚胎表达外源Noggin的区域。（D）爪蟾胚胎要么未注射，要么在单细胞期注射20 ng MoSNW1a。如图所示，在16至32个细胞阶段，将两组胚胎用8pg表达斑马鱼BMP2b的质粒或16pg同一质粒连同Fdx作为示踪剂注射到A1/B1/A2/B2的一个卵裂球中。胚胎在第14阶段固定，通过染色检测神经嵴鼻塞由WISH提供。用抗荧光素抗体观察Fdx。
图9
图9。SNW1函数模型。
示意图总结了我们在这两方面的发现爪蟾和斑马鱼胚胎。图示为胚胎的背前视图。
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中的注释

  • SNW1在早期胚胎模式中协调BMP信号。
    塞德威克C。 塞德威克C。 《公共科学图书馆·生物》。2011年2月15日；9（2）：e1001018。doi:10.1371/journal.pbio.1001018。 《公共科学图书馆·生物》。2011 采购管理信息：21347243 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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