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.2011年4月；152(4):1616-26.
doi:10.1210/en.2010-0903。 Epub 2011年2月1日。

KISS1R细胞内转运和降解：Arg386Pro疾病相关突变的影响

苏西·D·C·比安科 1, 劳伦·范德帕斯, 梅林·科雷亚·梅迪纳, Balázs Gereben先生, 阿比尔·穆克吉, 温迪·郭洪, 罗娜·卡罗尔, Milena G Teles公司, 安娜·克劳迪娅·拉特罗尼科, 乌苏拉·B·凯撒
附属公司

KISS1R细胞内转运和降解：Arg386Pro疾病相关突变的影响

苏西·D·C·比安科等。 内分泌学. 2011年4月.

摘要

本研究的目的是研究Arg386Pro突变如何延长KiSS-1受体（KISS1R）对kisspeptin的反应性，从而导致人类中枢性性早熟。共焦成像显示野生型（WT）KISS1R与膜标记物共定位，持续刺激5小时。相反，未检测到与溶酶体标记的共定位。此外，用溶酶体抑制剂隔夜治疗不会影响WT KISS1R蛋白，而用蛋白酶体抑制剂隔天治疗会使蛋白水平增加24倍。WT和Arg386Pro KISS1R在刺激后表现出时间依赖性内化。然而，这两种受体都被回收到膜上。与WT KISS1R相比，Arg386Pro突变在长达120分钟的刺激时间内不会影响KISS1R在膜和内化组分中的相对分布，这表明该突变不会影响KISS1R的贩运率。然而，在kisspeptin刺激120分钟后，与WT相比，总Arg386Pro KISS1R显著增加。通过阻断回收受体的检测，这种净增加被消除，这表明回收受体是该突变对kisspeptin反应性增加的原因。因此，我们得出以下结论：1）WT KISS1R被蛋白酶体而非溶酶体降解；2） WT和Arg386Pro KISS1R在刺激时被内化，但大多数内化的受体被再循环回膜而不是降解；3） Arg386Pro突变并不影响KISS1R贩运的速率，相反，它通过减少KISS1R降解来延长对kisspeptin的反应性，从而导致再循环回质膜的突变受体的净增加。

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数字

图1。
图1。
KISS1R信号转导与CHO-KISS1R细胞的贩运。A、 kisspeptin对总肌醇磷酸生成的影响。用10−9 米kisspeptin 0～18h后溶解。提取总肌醇磷酸盐并将其标准化为蛋白质含量。数据为平均值±东南方代表性实验中的三份样品，重复至少三次，结果相似。B、 KISS1R贩运率。CHO-KISS1R细胞在冰上以100000 cpm的125I-kisspeptin，然后在37℃下孵育0-60分钟，如图所示。膜结合125I-kisspeptin通过酸性洗涤提取并内化125细胞裂解后收集I-kisspeptin。的分布125膜中的I-kisspeptin(开放式酒吧)并内化(阴影条)分数表示为125I-kisspeptin在指定的特定时间点。结果为平均值±扫描电镜三个独立实验的结果。
图2。
图2。
共焦显微镜下KISS1R的亚细胞定位。表达MYC-KISS1R（Na）的COS-7细胞+K（K）+ATPase共定位）或CFP-KISS1R（Lamp2共定位）被10−7 米kisspeptin作用0-5h。抗CFP抗体与FITC偶联(绿色)，而膜（Na+K（K）+ATPase）和溶酶体（Lamp2）标记物通过Alexa-568结合抗体显现(红色). 纳+K（K）+ATP酶（A）、基线时KISS1R（B）和合并（A+B）图像（C）；纳+K（K）+kisspeptin刺激3h后ATP酶（D）、KISS1R（E）和融合（D+E）图像（F）；Lamp2（G）、基线处KISS1R（H）和合并（G+H）图像（I）。注：D–F，与其他单元格相比，特征单元格位于上共焦平面中。Nuclei如所示蓝色（DAPI）。图像的放大倍数由白色条（刻度，20μ米).
图3。
图3。
通过标记的KISS1R进行绑定和信号传递。A和C，MYC-（A）和CFP-（C）KISS1R结合置换分析。将表达未标记或标记的KISS1R的COS-7细胞与125I-kisspeptin单独或在浓度增加的情况下（10−10到10−6 米)未标记的kisspeptin。结果为平均值±东南方代表性实验中三份样品的最大结合率(即，在没有未标记的kisspeptin的情况下具有约束力）。实验重复至少三次，结果相似。B和D，MYC-（B）或CFP-（D）KISS1R生产的总肌醇磷酸盐。表达未标记或标记KISS1R的细胞受到kisspeptin浓度增加的刺激（10−10到10−7 米)在37℃下放置2小时。结果为平均值±东南方代表性实验的三倍。实验重复至少三次，结果相似。打开的圆圈，未标记的KISS1R；正方形，MYC-KISS1R；三角形，CFP-KISS1R。
图4。
图4。
MYC-KISS1R的Western-Blot检测。将表达MYC-KISS1R的COS-7（A）或HEK-293（B）细胞在37℃下与leupeptin（溶酶体抑制剂）孵育16小时，或与MG132（蛋白酶体抑制剂）培养2小时或16小时，然后再进行溶解。细胞裂解物用单克隆抗myc抗体进行免疫沉淀（IP），然后进行Western blot分析。使用多克隆抗MYC抗体（1:1000）和荧光标记的红外染料IRDye-800CW-共轭抗兔抗体（1:5000）检测全细胞裂解物或抗MYC免疫沉淀剂中的MYC-KISS1R。通道1至5装载免疫沉淀复合物，通道6至10装载相应的前IP全细胞裂解物。车道1和6，控制矢量；车道2和7，仅MYC-KISS1R；第3和第8通道，MYC-KISS1R+亮肽（16小时）；车道4和9，MYC-KISS1R+MG132（2小时）；车道5和10，MYC-KISS1R+MG132（16小时）。右边的箭头指向43 kDa的KISS1R单体。展示了典型实验的Western blot。实验重复至少三次，结果相当。
图5。
图5。
KISS1R的膜贩运。表达野生型（WT）或Arg386Pro KISS1R的COS-7细胞用125如图所示，在37℃孵育0–120分钟之前，将I-kisspeptin置于冰上。膜和内化125I-kisspeptin按照材料和方法.A，WT和Arg386Pro KISS1R中的膜运输速率（内化和再循环）表示为膜中受体的相对分布，并在每个时间点内化。左侧面板，膜中受体的相对百分比；右侧面板，内化受体的相对百分比。结果为平均值±东南方七个独立实验。开放式酒吧，WT KISS1R；实心钢筋，Arg386Pro KISS1R。B、 检测回收受体的KISS1R总贩运量。膜受体总数(左侧面板)或内化(右侧面板)分数表示为cpm/mg蛋白质的平均值±东南方在这个具有代表性的实验中，重复至少三次，结果具有可比性。开放式酒吧，WT KISS1R；实心钢筋，Arg386Pro KISS1R.***，P（P）<0.0002（学生）t吨测试与。120分钟C时的WT受体，KISS1R（总）内化与循环受体检测的比率：刺激的时间进程。条形图表示三个独立实验得出的组合比率。通过将Arg386Pro KISS1R三次测量值的平均值除以WT受体三次测量的平均值，计算每个实验中的比率。*，P（P）ANOVA和Dunnett检验均<0.05与。时间零点。D和E，在未检测回收受体的情况下测量KISS1R贩运：去除放射性配体的影响。在D和E中，未绑定125I-kisspeptin在冰上平衡结束后，但在37℃孵育之前被去除，因此只有在时间零点与放射配体结合的受体才能被检测到，并在之后进行追踪。D、 （总）受体表示为平均值±东南方代表性实验中的三份样品（cpm/mg蛋白质），重复至少三次，结果具有可比性。开放式酒吧，WT KISS1R；实心钢筋，Arg386Pro KISS1R。左侧面板，总膜受体；右侧面板，总的内化受体。E、 Arg386Pro:WT KISS1R的组合比率。条形图表示三个独立时间过程实验得出的平均比率。通过将Arg386Pro KISS1R的三份样品的平均值除以同一试验中WT KISS1R的三份样本的平均值，计算每个试验的比率。左侧面板(开放式酒吧)，膜中的比率；右侧面板(实心钢筋)，内化受体比率。F、 未检测到回收受体的KISS1R贩运：莫能菌素预处理的影响。在添加前用莫能菌素（循环抑制剂）孵育30分钟125I-kisspeptin阻止再循环受体重新插入细胞膜。结果为平均值±东南方来自代表性实验的三份样品，显示为Arg386Pro与WT KISS1R的比率。左侧面板(开放式酒吧)，膜中的比率；右侧面板(实心钢筋)，内化受体比率。
图6。
图6。
提出KISS1R贩运模型和Arg386Pro突变的影响。在基础条件下，在膜上检测到类似数量的受体（七个受体），并在表达WT的细胞内内化（三个受体）部分(左上角)或Arg386Pro(左下角)KISS1R。基线时的相对分布也相似：70%在膜上，30%在两个WT中内化(左上角)和Arg386Pro(左下角)KISS1R。刺激120分钟后，WT的相对分布保持相似(右上角)和Arg386Pro(右下角)KISS1R：40%在膜上，60%内化。然而，受体总数不再相似。膜上WT KISS1R减少至4，内化至6(右上角)而Arg386Pro KISS1R在刺激后两个组分上均增加：膜上11个，内化17个(右下角). 一小部分受体在内化后被降解，Arg386Pro KISS1R降解速率的降低被认为是增加该突变体的细胞内积累，这与动态循环相结合足以解释该突变体对kisspeptin反应性的时间依赖性放大。基线时未首次检测到的细胞内KISS1R池（in灰色)被提议补充到膜上，从而解释了刺激后受体数量的明显增加。此图中的值基于图5B中所示的数据。
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