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.2011年1月17日；6（1）：e15834。
doi:10.1371/journal.pone.0015834。

聚ADP-核糖聚合酶3在外胚层规范和神经嵴发育中的关键作用

米歇尔·鲁洛 1, 维沙尔·萨克塞纳, 艾米莉·罗德里格, 埃里克·帕奎特, 阿比·加格农, 迈克尔·亨泽尔, Jean-Yves Masson女士, 马克·埃克尔, 盖伊·波里埃
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聚ADP-核糖聚合酶3在外胚层规范和神经嵴发育中的关键作用

米歇尔·鲁洛等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景：PARP家族成员聚（ADP-核糖）聚合酶3（PARP3）在结构上与特征明确的PARP1相关，PARP1通过合成聚（ADP核糖）调控细胞对DNA链断裂和细胞死亡的反应。与PARP1和PARP2相比，PARP3的功能未定义。在这里，我们揭示了PARP3在脊椎动物发育过程中的关键功能。

主要发现：我们使用了几种体外和体内方法来检测PARP3作为转录调节器的可能功能，这一功能是根据其与多个Polycomb组（PcG）蛋白的先前报道的关联而提出的。我们证明，PARP3基因在人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH中的占据优先发生，发育基因调节细胞命运规范、组织模式、颅面发育和神经发生。针对斑马鱼发育过程中这种关联的重要性，我们发现吗啉寡核苷酸对斑马鱼parp3表达的直接抑制会损害神经嵴细胞特异性sox9a和dlx3b/dlx4b的表达，以及颅骨感觉板、内耳和胸鳍的形成。它延缓了色素沉着，严重阻碍了中鳍褶和尾芽的发育。

结论：我们的研究结果表明，Parp3在斑马鱼发育的早期阶段至关重要，可能是通过早在神经板边界规范化期间发挥其转录调控功能。

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数字

图1
图1。斑马鱼胚胎发育障碍第3部分表达式。
A.野生型斑马鱼Parp3的免疫印迹分析（上图）和第3部分使用抗人PARP3抗体的变体（MO）。显示了人SK-N-SH细胞的全细胞提取物作为对照。PARP3对应的蛋白质带用“>”表示。快速迁移带对应于与抗体交叉反应的非相关蛋白。Western blot膜用Ponceau S染色，作为蛋白质负荷对照（下面板）。B.野生型头部区域和第3部分注入4 ng MO1的变体。wt胚胎中的内耳（小箭头）和胸鳍（大箭头）不是在第3部分变体。C.野生型和第3部分注入4 ng MO1的变体。中间鳍褶（箭头）在变形体中较不发达，具有更细粒度的外观。背部的影响更为明显（箭头所示）。斑马鱼胚胎注射越来越多的第3部分-单细胞期的特异性吗啉寡核苷酸MO1（ng数量显示在右下角）。随着MO1注射量的增加，变形胚胎的长度变短、尾巴弯曲以及色素沉着减少的情况越来越严重。侧视图，右前方，顶部后方。比例尺代表10µm。
图2
图2。PARP3与染色质和Polycomb蛋白相关。
A.将人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH分为核（P1）和细胞质（S2）组分。核P1组分进一步分离为核可溶性组分（S3）和染色质组分（P3）。免疫印迹法检测到的蛋白质显示出来。PARP1和p38 MAPK分别用作染色质和细胞质标记。每个分数的样本对应一个相等的单元数。B.SK-N-SH细胞中PARP3的免疫荧光检测。PARP3主要为细胞核，与三甲基组蛋白H3K27（H3K27me3）（箭头）共定位。比例尺代表3µm。C.用核PARP3对免疫沉淀蛋白（IP）进行免疫印迹分析。EZH2与PARP3共沉淀。输入相当于IP中使用的细胞提取物的10%。在对照（Ctrl）IP中使用兔IgG。
图3
图3。PARP3靶向发育基因。
A.根据基因本体注释富集PARP3靶点。B.ChIP-ChIP分析确定的PARP3靶向的发育相关转录因子家族。C.PARP3 ChIP-ChIP在SOX9和HOXC基因座上的显著信号。兔IgG用于对照ChIP。转录起始位点由箭头指示。
图4
图4。分析PARP3-结合目标。
A.通过ChIP-qPCR验证PARP3发育目标。根据ChIP-ChIP结果，使用PARP3靶区特异性引物，通过标准qPCR分析PARP3 ChIP。误差条表示三个独立实验的标准偏差，星号表示与对照组相比显著增加（p<0.05）。两个不受PARP3（非靶点）约束的控制区域（KRT20和OR8J1）用于确定基础信号。一些探针用于DLX基因。“DLX4”探针以启动子区域为目标，“在DLX内”探针以DLX基因内的目标序列为目标，而“在DLX3-DLX4内”探针则以DLX3-DL-X4基因间区域为目标。B.PARP3和SUZ12靶点或富含H3K27me3的序列之间的重叠。SUZ12和H3K27me3靶点是通过在人类胚胎成纤维细胞中测定的靶点。C.PARP3靶序列相对于转录起始位点（TSS）的分布。D.PARP3靶序列富集为CACCAGG序列（上部序列）。该序列与RE1沉默转录因子（REST）结合序列的一部分（较低序列）相匹配。
图5
图5。神经嵴细胞标记物的表达甲壳素在以下方面受损第3部分变体。
斑马鱼胚胎未经处理（WT）或注射4ng第3部分MO1和甲壳素原位杂交检测其表达。A.在16 hpf WT胚胎中，甲壳素表达于迁移前神经嵴细胞和迁移至前躯干节段的神经嵴。B.16 hpf第3部分变形体，甲壳素表情似乎普遍减少。C.通过24 hpf，冠-阳性细胞沿WT胚胎神经嵴迁移路径的前后轴分布。D.24 hpf第3部分变形体，甲壳素在头部不再检测到表达，在躯干中明显减少。胚胎的侧视图显示为左前方和顶部后方。比例尺代表10µm。
图6
图6。表达受损索克斯9a,dlx3b和dlx4b在里面第3部分变体。
斑马鱼胚胎未经处理（WT）或注射4ng第3部分原位杂交检测基因表达。A–F.的表达式sox9a公司在10hpf时耳板（小箭头）和16hpf时耳泡（箭头）中显著减少。的表达式索克斯9a体节细胞（中的小箭头B类和E类)在中显示为漫反射第3部分变体。的表达式索克斯9a在24 hpf（C，F）时头部几乎完全消除。的表达式dlx3b型(G–L)和dlx4b型(M–R（M–R）)受到的影响最小第3部分10 hpf（G，J，M，P）时外胚层细胞中的MO显著减少，但在耳泡（箭头）、嗅板（大箭头）和鳃弓（白色箭头）中显著减少第3部分16 hpf（H，K，N，Q）和24 hpf（I，L，O，R）的变体。的表达式dlx3b型和dlx4b型在24hpf的中间鳍折叠中被废除第3部分变形胚胎（中的小箭头我). 胚胎背视图在A、D、G、J、M、P中为底部前视图，在B、C、E、F、H、I、K、L、N、O、Q和R中为左侧前视图、顶部背视图。比例尺代表10µM。
图7
图7。的表达式神经细胞和nkx2.1个在里面第3部分变体。
表达式：A–F，神经细胞和G–J，nkx2.1a型在未注射胚胎或接受4ng第3部分MO1，通过原位杂交。A–D和G–J为侧视图，左前方，顶部后方。E–F是扁平胚胎的背面视图，位于左侧前方。ad/av/f：前背/前腹侧线/面部placodes/神经节；p： 后侧线板；e： 眼睛；o： 八级/静态听神经节前体；t： 端脑。比例尺代表10µm。
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