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比较研究
.2011年4月；300（4）：R844-54。
doi:10.1152/ajpregu.00528.2010。 Epub 2011年1月19日。

大脑和脊髓线粒体之间的代谢和功能差异是不同病理倾向的基础

亚历山大·帕诺夫 1, 纳塔利亚·库巴利克, 娜塔莉亚·津琴科, 雏菊M骑行, 大卫·A·拉多夫, Richelle Hemendinger先生, 本杰明·布鲁克斯, 赫伯特·邦科夫斯基
附属公司
比较研究

大脑和脊髓线粒体之间的代谢和功能差异是不同病理倾向的基础

亚历山大·帕诺夫等。 美国生理学杂志Regul Integr Comp Physiol. 2011年4月.

摘要

线粒体功能障碍会导致神经退行性病变，神经退行性病变的位置各不相同。为了了解肌萎缩侧索硬化症脊髓运动神经元与脑线粒体相比更易受损的机制，我们研究了大鼠脑线粒体（BM）和脊髓线粒体（SCM）线粒体的三个主要功能：氧化磷酸化、Ca（2+）隔离、，和活性氧（ROS）的产生，使用新的代谢范式（Panov等人，J.Biol.Chem.284:14448-144562009）。我们提供的数据表明，SCM与BM具有一些独特的代谢特性。然而，SCM也与BM有一些区别：1）除琥珀酸盐外，SCM在所有研究底物中的呼吸速率显著降低；2） 免疫印迹分析表明，这可能是由于呼吸酶和孔蛋白含量降低30-40%；3） 与BM相比，SCM螯合的Ca（2+）减少了40-50%，脊髓中的总组织钙含量高出8倍；4） 对1g组织的线粒体进行归一化后发现，BM可吸收的Ca（2+）是脑组织中可用Ca（2+）的数倍，而SCM仅能吸收组织总Ca（2%）的10-20%；和5）在琥珀酸和含有琥珀酸的底物混合物中，SCM表现出明显高于BM的状态4呼吸，并产生更多与反向电子传输相关的ROS。我们得出结论，SCM比BM具有更高的氧化损伤和钙超载风险，因此脊髓在某些病理条件下可能更脆弱。(250).

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数字

图1。
图1。
不同代谢状态下大脑和脊髓线粒体的呼吸活动。A： 状态4——静息呼吸。B：状态3-氧化磷酸化。C类：状态3U非耦合呼吸。D类：呼吸控制比率（V状态3/V（V）状态4). 培养条件：培养基A的组成见材料和方法.培养箱容积550μl，温度25°C。底物：谷氨酸盐5 mM+苹果酸盐2 mM，丙酮酸盐2.5 mM+马来酸盐2 m M，琥珀酸盐5 m M，抗坏血酸盐5 mM M+二乙酸四甲基磷（TMPD）0.3 mM。添加：线粒体蛋白0.3 mg；ADP，150μM；氰化间氯苯基腙（CCCP），0.4μm。结果显示为平均值±SE*P（P）< 0.1; **P（P）< 0.05; ***P（P）< 0.001. NS表示没有统计显著差异。将脊髓线粒体的数据与代表脑线粒体的相应列进行比较。
图2。
图2。
比较大脑和脊髓线粒体氧化各种底物及其混合物的呼吸活动。A类：状态4-休息呼吸。B：状态3-氧化磷酸化。C类：状态3U非耦合呼吸。培养条件如图1所示。名称：G+M，谷氨酸+苹果酸；P+M，丙酮酸+苹果酸；G+P+M、谷氨酸盐+丙酮酸盐+苹果酸盐；S、 琥珀酸；S+G+P+M，琥珀酸+谷氨酸+丙酮酸+苹果酸。带有G+M的列中的数字表示以纳米O为单位的平均呼吸速率2大脑和脊髓线粒体每分钟每毫克蛋白质*P（P）< 0.1; ***P（P）< 0.001. 为了便于比较，将所有数据与代表谷氨酸+苹果酸的第一列进行比较，取100%。
图3。
图3。
脑和脊髓线粒体蛋白与OXPHOS复合物和孔蛋白抗体的蛋白质印迹。技术细节见材料和方法.A类：典型SDS-PAGE凝胶的图像。B：脊髓线粒体中呼吸复合物和孔蛋白的相对数量归一化为脑线粒体。结果显示为平均值±SE(n个=5）定量Western blot的带强度，如材料和方法.
图4。
图4。
脑、脊髓和肝线粒体的蛋白质印迹，带有针对溶酶体和过氧化物酶体的标记抗体。肝匀浆轻组分（LHLF）作为阳性对照。RLM，大鼠肝线粒体。参见材料和方法了解详细信息。
图5。
图5。
分离的大脑和脊髓线粒体颗粒的数字电子显微照片。放大倍数：×10500。图中显示，大鼠脑线粒体（BM）和脊髓线粒体（SCM）均未肿胀，两个颗粒中均存在少量膜泡。SCM颗粒不包含任何其他会导致特定线粒体蛋白质含量降低的细胞成分。
图6。
图6。
用钙滴定大鼠脑和脊髓线粒体时膜电位和介质pH值的变化。A类：脑线粒体。B：脊髓线粒体。培养条件和培养基B的组成见材料和方法在线粒体（0.3 mg/ml）之前添加寡霉素（2μg/ml）和ADP（50μM）（最终浓度）。首次添加TPP+添加量分别为1nm/ml和0.5nm/ml。最终TPP+浓度为2.0 nm/ml，Ca2+100毫摩尔/毫升；甲氧苄青霉素，4μg/ml；HCl 125 nmol/ml导致ΔpH值为0.07。
图7。
图7。
大鼠脑和脊髓线粒体的钙保留能力。实心条表示脑线粒体；灰色条表示脊髓线粒体。孵化条件如图6所示。控制包括未受保护的线粒体氧化底物；ADP由寡霉素2μg/ml+ADP 50μM保护的线粒体组成；CsA+ADP包括受环孢菌素A保护的线粒体（0.5μM+寡霉素2μg/ml+ADP 50μM）。数据为M±标准误差，由线粒体的3-4个分离物计算得出。数据表示为纳米Ca2+每毫克线粒体蛋白。统计数据：**P（P）< 0.05; ***P（P）< 0.001. 将脊髓线粒体的数据与代表脑线粒体的相应数据进行比较。
图8。
图8。
大脑和脊髓组织总钙2+从1g组织中分离出的线粒体的含量和钙保留能力。数据以微克Ca表示2+每1g湿纸巾。实心条表示组织总钙2+内容；光条表示存在寡霉素2μg/ml+ADP 50μM时的线粒体钙保留能力。将脊髓线粒体的数据与代表脑线粒体的相应数据进行比较，并将线粒体CRC与相应的组织总钙进行比较***P（P）< 0.001.
图9。
图9。
H的生成2O（运行）2通过大鼠脑和脊髓线粒体与不同底物和底物的混合物。线粒体按照材料和方法.总体积：1 ml。结果以平均值±SE表示(n个=6），并将ROS生成速率表示为皮摩尔H2O（运行）2每分钟每毫克线粒体蛋白。添加：5μM Amplex红色；3单位辣根过氧化物酶；50单位超氧化物歧化酶（Sigma）；0.05mg线粒体；谷氨酸5 mM+苹果酸2 mM（G+M）；丙酮酸2.5 mM+苹果酸2 mM（P+M）；谷氨酸5 mM+丙酮酸2.5 mM+苹果酸2 mM（G+P+M）；琥珀酸盐5mM+谷氨酸盐5mM+丙酮酸盐2.5mM+苹果酸盐2mM（S+G+P+M）*P（P）< 0.1; **P（P）< 0.05; ***P（P）< 0.001. 将SCM的数据与BM的相应结果进行比较。
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