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.2011年1月5日；31(1):359-70.
doi:10.1523/JNEUROSCI.2225-10.2011。

线粒体通透性转换孔调节靶剥夺诱导的一氧化氮介导的神经元凋亡

Lee J Martin（李·马丁） 1, 尼尔·A·亚当斯, 燕磐, 安·普莱斯, 澳门人玛嘉烈
附属公司

线粒体通透性转换孔调节靶剥夺诱导的一氧化氮介导的神经元凋亡

Lee J Martin（李·马丁）等。 神经科学. .

摘要

损伤后7天，小鼠枕叶皮层的消融诱导背侧外侧膝状体核（LGN）丘脑皮质投射神经元精确定时、均匀的p53调节和Bax依赖性凋亡。我们验证了这种神经元凋亡是由氧化应激和线粒体通透性转换孔（mPTP）启动的假说。与具有完整皮层靶点的LGN神经元相比，凋亡前的LGN神经元积累线粒体、Zn（2+）和Ca（2+），并产生更高水平的活性氧（ROS），包括超氧化物、一氧化氮（NO）和过氧亚硝酸盐。LGN神经元的凋亡前与蛋白质羰基、蛋白质硝化和蛋白质S-亚硝基化的形成增加有关。一氧化氮合酶1（nos1）的基因缺失和硝基吲哚唑对nos1的抑制保护了LGN神经元的凋亡，表明NO是一种介体。mPTP的假定成分在小鼠LGN中表达，包括电压依赖性阴离子通道（VDAC）、腺嘌呤核苷酸转运体（ANT）和亲环素D（CyPD）。皮质损伤后2天，LGN线粒体中的CyPD和ANT发生硝化反应。化学交联显示LGN神经元凋亡前与CyPD和VDAC寡聚体的形成有关，与mPTP的形成一致。与mPTP抑制剂TRO-19622（cholest-4-en-3-one oxime）和TAT-Bcl-X（L）-BH4治疗的小鼠一样，无CyPD的小鼠也可从神经元凋亡中拯救出来。操纵mPTP可显著减弱靶向神经元细胞凋亡前早期活性氧/氮的生成。我们的结果表明，在成年小鼠脑神经元中，mPTP具有增强ROS生成的功能，而mPTP和NO会触发细胞凋亡；因此，mPTP是体内神经保护的靶点。

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数字

图1。
图1。
靶向分化的dLGN神经元积累线粒体，并在细胞凋亡前提高活性氧的产生。A类,B类，dLGN神经元细胞体剖面的代表性电子显微照片，显示了控制目标接触神经元中线粒体的核周分布(A类)和一个目标神经元(B类)皮质消融后4d。线粒体（箭头所示）、细胞核和粗面内质网（RER）被鉴定出来。靶向神经元积累了线粒体（箭头所示），其中一些正在经历裂变(B类，右上插图）。比例尺：A类，左下角，1.7μm。C类，损伤后1、2、4、5和6天大脑皮层完整（对照组）和枕叶皮层消融的dLGN神经元胞体的连续电子显微照片得出的线粒体数量。值(n个=每组5只小鼠）是每个时间点分析的50个细胞的平均值±SD，在第2天出现显著增加(*第页<0.05）以及第4天和第5天(**第页<0.001），第7天出现显著下降(+第页<0.05）。插图显示靶剥夺后第六天，一个控制性dLGN神经元（左）和一个近终末期凋亡的dLGN神经细胞（右）。比例尺，4.5μm。D类，显示目标剥夺后第1、3、4、5、6和7天dLGN神经元胞体的体积（以控制百分比表示）的图表。数值为每个时间点分析的50个细胞的平均值±SD，在第4天时显著增加(*第页<0.05），第6天显著下降(+第页<0.05）和7天(++第页<0.001）。E类,F类，MitoTracker红色CM-H2枕叶皮质消融后第3天，对照对侧（control contralate，contra）和靶向同侧（target-deprived ipsi-depriveral，ipsi）dLGN神经元的XRos标记（白色箭头通过线粒体的荧光标记识别选定的神经元）。G公司图中显示了靶剥夺后第1、3、4、5、6和7天dLGN神经元胞体的MitoTracker红色荧光强度（以对照百分比表示）。值(n个=每组6只小鼠）是每个时间点分析的50个细胞的平均值±SD，在第3天和第4天显著增加(*第页<0.05），第6天出现显著下降(+第页<0.05）和7天(++第页<0.001）。H（H）,我枕叶皮质消融后第3天，HE标记对照对侧（control contralate，contra）和靶向同侧（target-deprived ipsi-legn，ipsi）dLGN神经元（白色箭头用荧光标记识别选定的神经元）。J型图中显示了靶剥夺后第1、3、4、5、6和7天dLGN神经元胞体的HE荧光强度（以对照百分比表示）。值(n个=每组6只小鼠）是每个时间点分析的50个细胞的平均值±SD。在第3天和第4天显著增加(*第页<0.05），第6天出现显著下降(+第页<0.05）和7天(++第页<0.001）。K（K）,L（左）在枕叶皮质消融后第3天，DCF标记对照对侧（control contralate，contra）和靶向同侧（target-deprived ipsi-legn，ipsi）dLGN神经元（白色箭头通过线粒体荧光标记识别选定的神经元）。M（M），显示靶剥夺后第1、3、4、5、6和7天dLGN神经元胞体DCF荧光强度的图表（以对照组百分比表示）。值(n个=每组6只小鼠）是每个时间点分析的50个细胞的平均值±SD。第3、4和5天出现显著增加(*第页<0.05），第7天显著下降(+第页<0.001）。
图2。
图2。
凋亡前dLGN神经元积累氧化损伤、硝化蛋白和S公司-亚硝化蛋白质类。A类，如前所述，分离成线粒体（顶部印迹）和可溶性（底部印迹）蛋白质组分后，对同侧靶区分离和对侧靶区接触LGN进行Oxyblot分析（Martin等人，2003）。来自同侧LGN的线粒体蛋白质（5μg/lane）在第3天显示出蛋白质羰基的适度增加，然后在第4天显示出突然强劲的蛋白质羰基瞬时积累。分子量标准（千道尔顿）如右图所示。用于线粒体提取的同一LGN样品的可溶性蛋白提取液在同侧和对侧之间没有差异。结果在每组四只不同的小鼠中重现。膜的Ponceau S染色显示了等效输入（显示在每个氧印迹的底部）。B类Western blot检测枕皮质消融后4d同侧和对侧LGN总提取物中3-硝基酪氨酸免疫反应蛋白。同侧LGN显示40–125 kDa范围内硝化蛋白的显著积累。分子量标准（单位：千道尔顿）如右图所示。蛋白质负荷控制显示在底部。结果在四只不同的小鼠中重现。C–E，dLGN中3-硝基酪氨酸免疫反应的免疫组织化学定位。免疫过氧化物酶用于用3-硝基酪氨酸和DAB（棕色）单克隆抗体显示硝化蛋白，然后用甲酚紫对切片进行复染。靶剥夺后第4天，同侧dLGN的神经元出现明显的聚集(C类，箭头）。同一切片上对侧dLGN仅显示微弱标记(D类). 在靶点剥夺后6天，终末期凋亡谱变得清晰可见(E类，箭头），而3-硝基酪氨酸免疫反应消失。比例尺：（inC类)C–E，12μm。F类图中显示了靶剥夺后1、3、4、5和6天3-硝基酪氨酸阳性dLGN神经元胞体的数量。值(n个=每组6只小鼠）为平均值±SD。在第3天观察到显著增加(*第页<0.05），4天(**第页<0.01）和5天(*第页<0.05）。G公司,S公司-靶剥夺后4d小鼠脑LGN中蛋白质的硝基化。蛋白质S公司-使用生物素开关法检测亚硝化作用（Jaffrey和Snyder，2001）。同侧LGN显示出明显的亚硝化蛋白质积累（每条通道中装载3.5μg蛋白质）。分子量标准（单位：千道尔顿）如右图所示。蛋白质输入显示在底部。蛋白质生物素化阳性对照为生物素标记的IgG。
图3。
图3。
细胞内钙的早期失调2+，锌2+以及靶向缺失的dLGN神经元中的NO。A类,B类在枕叶皮质消融后2 d，Fura-2 AM-dextran标记对照对侧（control contralate，contra）和靶向缺失同侧（target-deprived ipsi-deprive，ipsi）dLGN神经元。在对照神经元中可见非常微弱的荧光信号，而在细胞内钙浓度较高2+信号出现在靶缺失神经元中（箭头）。比例尺：（inA类)A–E，12微米。C类图中显示了靶剥夺后1和12小时（hr）以及1、2、3、4和5天dLGN神经元胞体的fura-2 AM-dextran荧光强度（以对照百分比表示）。值(n个=每组6只小鼠）是每个时间点分析的50个细胞的平均值±SD，显示出显著增加(*第页<0.05或**第页<0.01）。D类,E类在枕叶皮质消融后第2天，DAA标记对照对侧（control contralate，contra）和靶向同侧（target-deprived ipsi-depriveral，ipsi）dLGN神经元。在对照神经元中未观察到荧光信号，而在靶向缺失神经元中观察到强烈的细胞内No信号（箭头）。F类，显示靶剥夺后1和12小时（小时）以及1、2、3、4和5天dLGN神经元胞体DAA荧光强度的图表（以对照百分比表示）。值(n个=每组6只小鼠）是每个时间点分析的50个细胞的平均值±SD，显示出显著增加(*第页<0.05或**第页<0.01）。G公司,H（H）在枕叶皮质消融后6 h，FluoZin-3标记对照对侧（control contralate）和靶向同侧（target-deprived ipsi-depriveral）dLGN神经元。在对照神经元中未观察到荧光信号，而细胞内锌含量较高2+信号出现在靶缺失神经元中（箭头）。比例尺：（inG公司)G公司,H（H），12微米。我图中显示了靶剥夺后1、6和12小时（小时）以及1、2、3、4和5天dLGN神经元胞体的FluoZin-3荧光强度（以对照百分比表示）。值(n个=每组3只小鼠）是每个时间点分析的50个细胞的平均值±SD，显示出显著增加(*第页<0.05或**第页P<0.01）。
图4。
图4。
nNOS介导靶剥夺诱导的dLGN神经元凋亡。A类,B类，免疫组织化学显示靶剥夺后第2天（2d）同侧dLGN中nNOS上调(A类). 比例尺：（inA类)A类,B类，30微米。dLGN中nNOS的免疫反应性较低，2d时皮质靶点完整(B类).C类Western blot显示靶剥夺后2、4和5天，同侧与对侧LGN的nNOS上调。β-微管蛋白的蛋白质印迹显示为蛋白质负载。D类，显示nNOS中dLGN神经元数量的图表−/−和iNOS−/−小鼠枕叶皮质消融后7d。数值为平均值±SD(n个＝每个基因型8只小鼠）。星号表示与野生型显著不同(第页< 0.01).E类图中显示了每天（25 mg/kg，i.p.）用nNOS抑制剂3-溴-7-硝基吲哚唑（7-NI）或载体（花生油）治疗的野生型小鼠枕皮质消融后7天的dLGN神经元数量。数值为平均值±SD(n个=每组8只小鼠）。星号表示与野生型显著不同(第页< 0.01).
图5。
图5。
mPTP通过增加ROS的生成，驱动靶剥夺诱导的dLGN神经元凋亡，并与mPTP蛋白集合的形成和核心成分的硝化有关。A类Western blot显示靶剥夺后3、4、5和6天，同侧和对侧LGN中mPTP的三个核心成分（VDAC、ANT和CyPD）。在还原条件下，单体蛋白水平没有明显变化。B类，显示CyPD枕叶皮质消融后第7天dLGN神经元数量的图表−/−两种不同遗传背景的小鼠。数值为平均值±SD(n个=每个基因型10只小鼠）。星号表示与野生型显著不同(第页< 0.001).C类，显示每天治疗野生型小鼠枕叶皮质消融后第7天dLGN神经元数量的图表（10μ米，i.c.v.）与TRO-19622或车辆。数值为平均值±SD(n个=每组8只小鼠）。星号表示与野生型显著不同(第页< 0.01).D类，显示每天治疗野生型小鼠枕叶皮质消融后第7天dLGN神经元数量的图表（10μ米，i.c.v.）和TAT-Bcl-XL（左）：BH4或车辆。数值为平均值±SD(n个＝每组8只小鼠）。星号表示与野生型显著不同(第页< 0.01).E类，在单侧靶标剥夺后第3天用化学交联剂处理的野生型小鼠LGN中CyPD和VDAC的蛋白质印迹。显示了同一小鼠的同侧和对侧LGN提取物。对侧和同侧LGN中均可见在～20kDa处以可比数量检测到的单体CyPD，但仅在同侧LGN中可见较高分子量形式的CyPD（星号）。膜的Ponceau S染色显示了每条通道中的蛋白质负荷（底部）。在～33 kDa时检测到单体VDAC。单体VDAC在对照对侧LGN中占主导地位，在～45kDa时VDAC的条带免疫反应性较低。VDAC的这种更高分子形式（箭头）在目标产物LGN中占主导地位，而单体在交联条件下消散。膜的Ponceau S染色显示了每条通道中的蛋白质负荷（底部）。CyPD免疫印迹在免疫沉淀用粗馏分的～25%上显示等效裂解物输入。LGN提取物免疫沉淀阴性对照为正常免疫前IgG。F类硝化蛋白的免疫沉淀和Western blotting显示，靶剥夺后2天，CyPD和ANT在LGN中被硝化。用3-硝基酪氨酸单克隆抗体（1μg）免疫沉淀同侧和对侧LGN样品（250μg蛋白质），并分别进行SDS-PAGE和CyPD、ANT和VDAC的顺序蛋白质印迹。G公司，图中显示野生型和CyPD中dLGN神经元的HE荧光强度−/−小鼠在靶剥夺后3d。值(n个=每组4只小鼠）是每只小鼠分析的100个细胞的平均值±SD（以对侧百分比表示）。H（H），显示野生型和CyPD中dLGN神经元DAA荧光强度的图表−/−小鼠在靶剥夺后3d。值(n个=每组4只小鼠）是每只小鼠分析的100个细胞的平均值±SD（以对侧百分比表示）。
图6。
图6。
示意图说明了在我们的动物模型中导致神经元凋亡的可能事件序列。这种神经元细胞死亡是高度同步和均匀的凋亡。该方案是根据本研究和其他研究的数据生成的（Al-Abdulla和Martin，1998年；Martin等人，2001年和2003年）。到目前为止，我们检测到的最早的凋亡前事件是细胞内锌的积累2+与之前的发现一致（Land and Aizenman，2005）。
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