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.2011年8月；163(8):1666-78.
doi:10.1111/j.1476-5381.2010.01146.x。

脯氨酸寡肽酶以一种新的调节方式在体内外诱导血管生成

T T Myöhänen公司 1, 特诺里奥·拉兰加J, B约基宁, R Vázquez-Sánchez先生, M J莫雷诺-巴亚拉, J A GarcíA-Horsman（加西亚·霍斯曼）, P T Männistö
附属机构

脯氨酸寡肽酶以一种新的调节方式在体内外诱导血管生成

T T Myöhänen公司等。 杂志. 2011年8月.

摘要

背景与目的据报道，丝氨酸蛋白酶脯氨酸寡肽酶（POP）参与了前体43米胸腺肽β4（Tβ4）释放促血管生成四肽乙酰基-N-Ser-Asp-Lys-pro（Ac-SDKP）。最近，研究表明，恶性肿瘤患者的POP活性和Ac-SDKP水平均增加。本研究的目的是阐明Ac-SDKP的释放，并测试POP和POP抑制剂4-苯基-丁酰基-L-脯氨酸-2（S）-氰基吡咯烷（KYP-2047）能否影响血管生成。实验方法我们使用HPLC进行生物分析，使用酶免疫分析进行药理分析。在成年雄性大鼠体内使用Matrigel plug assay（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）在体外和体内使用“试管形成”试验评估人类脐静脉内皮细胞的血管生成。此外，还研究了POP与血管的共定位。关键结果我们显示了Tβ4的顺序水解：蛋白酶水解到<30聚体肽的第一步是POP的作用。出乎意料的是，POP抑制了第一个水解步骤，揭示了一种新的调节系统。与添加Tβ4本身相比，添加Tβ4的POP显著诱导了两种模型中的血管生成，而KYP-2047有效阻止了血管生成。POP和内皮细胞在体内大量共存。结论和意义我们现在发现POP是Tβ4释放Ac-SDKP的第二步酶，在第一步具有新的自身调节作用。我们的结果也支持Ac-SDKP在血管生成中的作用，并表明POP通过其前体Tβ4释放Ac-SDKP而发挥促血管生成作用，POP抑制剂可以阻断这种作用。

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图1
图1
全长胸腺肽β4（Tβ4）不被重组脯氨酰寡肽酶（POP）裂解在体外.肽混合物的RT-HPLC图谱，仅包含纯Tβ4肽（对照）、肽和重组POP（0.625µM；POP）以及肽、重组POP和4-苯基-丁酰基-L-脯氨酸-2(S公司)-氰基吡咯烷（KYP-2047；0.5µM；POP+KYP）。生长抑素28（1–12）被POP降解并用作阳性对照。
图2
图2
胸腺肽β4（Tβ4）与肾匀浆孵育后主要产物的特征以及脯氨酰寡肽酶（POP）对乙酰基-N-Ser-Asp-Lys-Pro（Ac-SDKP）释放的影响。在肾匀浆存在的情况下，鉴定对应于50µM Tβ4降解产物的HPLC洗脱峰（A）。通过质谱和Edman N末端测序鉴定了Tβ4降解的序列（肾脏匀浆控制中存在1–4，*无关肽）。（B） 在不同剂量的肾匀浆中Tβ4降解的最后两个产物的分布。POP明显增加Ac-SDKP（4）的量，而POP抑制剂4-苯基-丁酰基-L-脯氨酸-2的量(S公司)-氰基吡咯烷（KYP-2047）降低Ac-SDKP水平。在之前的降解步骤（Tβ4 2–7；3）中，POP的添加降低了底物的水平。酶免疫分析（C）证实了HPLC分析结果和POP抑制剂对Ac-SDKP水平的影响。在肾脏匀浆与Tβ4的添加（2µM）孵育80分钟后，KYP-2047在浓度为0.1µM时显著降低Ac-SDKP的量(P（P）与2µM Tβ4组和0.5µM组相比<0.05(P（P）与2µM Tβ4组相比<0.01）。（B） 对照组，纯肾匀浆；POP，存在0.625µM重组POP的肾匀浆；KYP，存在0.5µM KYP-2047的肾匀浆。a中，P（P）与对照组相比，POP添加量<0.05；b、，P（P）与KYP-2047相比，POP添加量<0.05*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
图3
图3
脯氨酸寡肽酶（POP）抑制大鼠肾匀浆中胸腺肽β4（Tβ4）处理过程中的第一次分裂。添加重组POP（0.625µM）抑制了外源性添加的Tβ4（50µM；A）的降解，并减少了其两个主要片段Tβ4的数量，即Tβ4片段（7-44）（B）和Tβ4片断（8-44）（C）（见图2中的序列和细节）。一种特殊的POP抑制剂4-苯基-丁酰基-L-脯氨酸-2(S公司)-氰基吡咯烷（KYP-2047）对Tβ4或其片段的降解没有任何影响。条件为：对照组，纯肾匀浆；POP，存在0.625µM重组POP的肾匀浆；KYP，在0.5µM KYP-2047存在下的肾匀浆。a中，P（P）与对照组相比，POP添加量<0.05；b、，P（P）与KYP-2047相比，POP添加量<0.05。
图4
图4
KYP-2047和人重组脯氨酰寡肽酶（POP）蛋白对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）成管的影响在体外，使用Matrigel试管形成分析进行评估。两种剂量的4-苯基-丁酰基-L-脯氨酸-2(S公司)-与4µM Tβ4组（A，B；P（P）< 0.001). 添加0.625µM POP和4µM Tβ4后，在4 h时间点（A；P（P）<0.05），但不在6小时时间点。有趣的是，添加Tβ4（被认为是阳性对照）在任一时间点（a、B）都没有增加对照组上方的试管形成，可能是因为这些细胞中缺乏内部POP。当添加不含Tβ4的10µM KYP-2047时，它对试管形成没有影响（A、B、H；10µM KYP）。右侧面板（C–H）显示了具有代表性的显微照片，描述了HUVEC在4小时时间点的不同条件下的试管形成***P（P）< 0.001; *P（P）< 0.05.
图5
图5
4-苯基-丁酰基-L-脯氨酸-2的作用(S公司)-氰基吡咯烷（KYP-2047）和人重组脯氨酰寡肽酶（POP）蛋白对血管生成的影响体内在Matrigel塞试验中。两种剂量的KYP-2047均将CD-31免疫反应性测定的血管生成抑制至对照水平[A；P（P）与胸腺肽β4（Tβ4）组相比，Matrigel塞试验结果<0.001。此外，与4µM Tβ4自身相比，添加0.625µM POP和4µTβ4明显增加了血管生成（A；P（P）< 0.001). 代表性荧光显微照片（B–F）显示了不同治疗组Matrigel塞试验中荧光染色的CD-31免疫反应细胞***P（P）< 0.001.
图6
图6
脯氨酰寡肽酶（POP）与CD-31在Matrigel塞试验中的共定位。在POP组（a–C）和KYP 5µM组（D–F）的Matrigel插头的双标记免疫荧光中，CD-31（绿色；荧光素标记）与POP（红色；德克萨斯红标记）共定位。橙色/黄色表示共同定位。比例尺为20µm。Tβ4，胸腺肽β4。
图7
图7
胸腺肽β4两步水解为乙酰基-N-Ser-Asp-Lys-Pro（Ac-SDKP）的示意图。第一步是由目前尚未鉴定的蛋白酶降解，第二步是由脯氨酰寡肽酶（POP）水解。POP本身能够抑制第一步蛋白酶，从而自动调节整个水解链。
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