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.2011年1月;12(1):29-36.
doi:10.1038/ni.1968。 Epub 2010年12月5日。

通过SETD6使NF-κB亚单位RelA的赖氨酸甲基化,将组蛋白甲基转移酶GLP在染色质处的活性与NFκB信号的强直抑制偶联

附属公司

SETD6对NF-κB亚单位RelA的赖氨酸甲基化将染色质组蛋白甲基转移酶GLP的活性与NF-κB信号传导的强化抑制偶联

丹利维等。 自然免疫. 2011年1月.

摘要

蛋白质中赖氨酸残基甲基化的信号传递与多种生物和疾病过程有关,但许多人类蛋白赖氨酸甲基转移酶(PKMT)的催化活性和底物特异性尚不清楚。我们筛选了40多个候选PKMT,并将SETD6鉴定为一种甲基转移酶,该甲基转移酶可在Lys310(RelAK310me1)处单甲基化染色质相关转录因子NF-κB亚基RelA。SETD6介导的甲基化使RelA失去活性并减弱了RelA驱动的转录程序,包括原代免疫细胞中的炎症反应。RelAK310me1由组蛋白甲基转移酶GLP的ankryin重复序列识别,在基础条件下,通过GLP介导的组蛋白H3 Lys9(H3K9)甲基化促进RelA靶基因的染色质被抑制状态。蛋白激酶Cζ(PKC-ζ)在Ser311对RelA的NF-κB活化相关磷酸化阻断了GLP与RelAK310me1的结合,减轻了对靶基因的抑制。我们的发现建立了一个先前未被证实的机制,染色质信号通过该机制调节炎症程序。

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数字

图1
图1。SETD6单甲基酯RelA(K310)
(a)SETD6作为RelA赖氨酸甲基转移酶的鉴定。左,利用重组RelA的甲基化反应的放射自显影1–431作为底物和重组酶(如图所示的全长或SET域,请参见方法). 右图:反应中使用的重组酶的考马斯染色。给出了三个独立实验的代表性数据。(b)SETD6甲基化物RelA在K310。顶部:用野生型RelA进行SETD6催化甲基化分析的放射自显影1–431或指示的突变体。底部:反应中使用的蛋白质的考马斯染色。给出了三个独立实验的代表性数据。(c)SETD6单甲基酯RelA。RelA甲基化检测的质谱分析300–320肽±SETD6,如图所示。给出了两个独立实验的代表性数据。(d)体外RelA的单甲基化1–431通过SETD6。利用RelA上SETD6甲基化反应的指示抗体进行免疫印迹分析1–431或RelA1–431持有K310R替代品。给出了两个独立实验的代表性数据。(e)外源性SETD6单甲基化使细胞中K310处的RelA过度表达。转染FLAG-SETD6和RelA或RelA的293T细胞全细胞提取物(WCE)的免疫印迹分析K310R公司,用指示的抗体进行探测。WCE负载占总负载的5%。给出了三个独立实验的代表性数据。(f)Y285A作为催化失活SETD6突变体的鉴定。顶部:的放射自显影在体外与SETD6或SETD6的甲基化反应Y285A型在RelA上1–431底部:反应中使用的重组蛋白的考马斯染色。给出了两个独立实验的代表性数据。(g)SETD6对内源性RelAK310的单甲基化需要完整的催化SET结构域。来自用所示SETD6质粒转染的293T细胞的RelA免疫沉淀(IP)或WCE(占总数的5%)的免疫印迹分析。给出了三个独立实验的代表性数据。(h)内源性SETD6耗竭降低了内源性RelAK310me1。用对照或两个独立的SETD6靶向siRNAs处理的293T细胞的免疫印迹分析(g)。给出了三个独立实验的代表性数据。(i)在没有NF-κB刺激的情况下,RelA与染色质H3的关联。用所示抗体对RelA或对照IgG蛋白ChIPs进行免疫印迹分析。投入占总投入的5%。给出了两个独立实验的代表性数据。(j)RelAK310me1是一种与染色质相关的RelA物种。生化分离为以下组分的293T细胞的免疫印迹分析:Cyt:细胞质;Nuc:核质;铬:富含染色质。Tubulin和H3信号控制用于分馏的完整性。给出了两个独立实验的代表性数据。(k)TNF处理降低了染色质处RelAK310me1的检测。293T和U2OS细胞±TNF处理(10 ng/ml,1 h)后的(j)所示部分的免疫印迹分析。给出了两个独立实验的代表性数据。
图2
图2。RelA的SETD6单甲基化抑制RelA反式激活活性
(a)在RelA靶基因的启动子处富集RelAK310me1需要SETD6。在启动子处用对照或SETD6 siRNA处理的U2OS细胞中RelAK310me1的占有率IL8号机组,IL1a级,myc公司,ccnd1号机组(黑色条)和gapdh公司(灰条作为对照)通过实时(RT)PCR对ChIP样品进行测定。ChIP富集度显示为输入%(ChIP/输入×100)。(b)TNF治疗导致RelA靶基因启动子的RelAK310me1占用缺失。从U2OS(左)和THP-1细胞(右)±TNF刺激(20 ng/ml,持续1小时)进行ChIP分析,如(a)所示。(a)和(b)的阴性对照抗体ChIP如补充图9所示。(c)SETD6对NF-κB荧光素酶报告子(κB-Luc)的抑制具有剂量依赖性,需要完整的催化SET结构域。在U2OS细胞转染后24小时,随着所示质粒数量的增加,测定κB-Luc报告荧光素酶活性(归一化为Renila)以及与对照转染相比的相对变化。SETD6和SETD6的免疫印迹分析Y285A型显示表达式。(d)SETD6的耗竭增强了NF-κB驱动的报告者的TNF-诱导活性。用对照组或2个独立的SETD6 siRNAs±TNF处理(10 ng/ml,1小时)转染293T细胞,测定荧光素酶活性(c)。(e)通过RT-PCR测定RNAi在所示细胞系中敲除SETD6 mRNA的效率。(f–h)SETD6缺失增加了多种细胞类型中RelA靶基因的表达。对U2OS(f)、THP-1(g)和原代小鼠BMDM(mBMDM)细胞(h)转染对照组(ct)或两个独立的SETD6 siRNAs±TNF(20 ng/ml,1小时)或±LPS(100 ng/ml(1小时)的所示mRNAs进行RT-PCR分析。(a–h)中的误差线表示至少三次实验的±标准误差。
图3
图3。SETD6减弱RelA驱动的细胞增殖
(a)SETD6缺失的U2OS细胞的增殖率增加需要RelA。连续七天每天测定所示行中的细胞数。(b)增强SETD6缺失细胞的锚定非依赖性生长需要RelA。用指定的细胞系在软琼脂试验中对每个田地的菌落进行定量。(c)SETD6缺失MEF的增殖率增加需要RelA蛋白。Rela公司+/+Rela公司−/−用SETD6 shRNA或对照shRNA稳定地转导MEF,并按(a)所述进行分析。左面板:所示细胞系WCE的免疫印迹分析。(d–e)SETD6的催化活性是恢复SETD6缺失细胞正常生长速度所必需的。用SETD6或SETD6重组的U2OS(d)和3T3成纤维细胞(e)的生长曲线和WCE免疫印迹分析Y285A型如图所示。(a–e)中的误差条表示至少三个独立实验的±标准误差。
图4
图4。SETD6减轻RelA驱动的炎症反应
(a)SETD6 mRNA表达与NF-kB相关炎症疾病呈负相关。左:类风湿关节炎(RA)患者(n=8)的SETD6表达水平低于健康对照组(n=15)(p=0.00036,双尾t检验)。表达式级别显示为标准化日志2样品与普通参考物的比率。右图:与健康对照组(n=15)相比,感染性休克患者(n=30)的SETD6表达较低(p=0.0015,双尾t检验)。请参见方法获取数据源和详细的筛选条件。(b)SETD6缺失增强了THP-1单核细胞中TNF诱导的细胞因子分泌。用对照(ct)或SETD6 siRNA±TNF(20 ng/ml)转染THP-1细胞。ELISA法测定培养上清液中指示细胞因子的分泌。(c)SETD6介导抑制mBMDM细胞中RelA靶基因表达以响应TNF的动力学。水平IL1a级TNF公司转染对照或SETD6 siRNA的mBMDM细胞经TNF治疗后,在指定的时间点通过RT-PCR测定mRNA。(d)mBMDM细胞中SETD6缺失增强了TNF诱导的大量RelA调节细胞因子的分泌。原代mBMDM细胞按(c)处理,培养上清液在2小时内通过多重ELISA检测指示的细胞因子。y轴:(SETD6 siRNA细胞因子水平/对照siRNA−1)×100。给出了两个独立实验的代表性数据。(e)siRNA介导的原代人单核细胞衍生树突状细胞(hMDDC)中SETD6的缺失。用一个对照(ct)siRNA或两个独立的SETD6 siRNA转染来自三个个体供体的hMDDC,并通过RT-PCR分析测定SETD6 mRNA的数量。(f)SETD6缺失增强了LPS诱导的原发性hMDDC中TNF和IL6细胞因子的分泌。(左)如(e)所示,在6小时和24小时测量的hMDDC分泌的指示细胞因子的平均倍变化。(右)用10或100 ng/ml的LPS治疗24小时后从单个人类供体分离的hMDDCs的细胞因子分泌(ng/ml),并转染指示的siRNA。(b,c,e,f)中的误差线表示至少三个独立实验的±标准误差。
图5
图5。GLP锚蛋白重复结构域特异性结合RelAK310me1
(a)GLP锚蛋白重复结构域作为RelAK310me1结合伙伴的鉴定。用所示肽探测含有268个独特结构域的CADOR微阵列(补充图17)。给出了三个独立实验的代表性数据。(b)通过肽结合分析验证CADOR阵列结果。GST-GLP生物素化肽下拉试验澳大利亚国家银行给出了三个独立实验的代表性数据。(c)GLP公司澳大利亚国家银行绑定到RelA在体外需要通过SETD6使RelA单甲基化。使用模拟或SETD6-甲基化RelA的αRelA IP的免疫印迹1-431和GLP澳大利亚国家银行并用指示的抗体进行探测。输入:IP所用原材料的10%。给出了两个独立实验的代表性数据。(d)野生型RelA,但不是RelAK310R,与GLP共免疫沉淀。免疫印迹分析用转染该质粒的293T细胞的αFlag-GLP免疫沉淀物和WCE的指示抗体进行检测。WCE:10%。给出了两个独立实验的代表性数据。(e)SETD6过度表达驱动GLP和RelA之间的内源性相互作用。293T细胞±SETD6转染的αRelA-IP和WCE的免疫印迹分析。WCE:10%。给出了两个独立实验的代表性数据。(f)生理性RelA-GLP相互作用需要内源性SETD6。免疫印迹分析(e))±SETD6 siRNA。显示了两个独立实验的代表性数据。(g)TNF处理抑制了RelA和GLP之间的相互作用。免疫印迹分析(e)转染GLP±TNF处理的U2OS细胞(10 ng/ml)。给出了两个独立实验的代表性数据。(h)在RelA靶基因启动子上GLP和H3K9me2的占据需要SETD6,并且被TNF处理抑制。GLP和H3K9me2在IL8号机组MYC公司用对照(ct)或SETD6 siRNAs±TNF处理(20 ng/ml)的U2OS细胞中的启动子如图2a所示。阴性对照抗体ChIP如补充图19所示。误差条表示至少三个实验的±s.e.m。
图6
图6。通过PKCζ阻止RelA在S311的磷酸化,GLP识别RelAK310me1
(a)调节RelAK310me1 GLP识别的RelA K310和S311处的甲基磷开关示意图。(b)RelAS311磷酸化阻断了GLP与RelAK310me1的结合。利用GST-GLP进行生物素化肽下拉分析,如图5b所示澳大利亚国家银行给出了两个独立实验的代表性数据。(c)PKCζ加利福尼亚州过度表达破坏了GLP和RelA之间的内源性相互作用。PKCζ±转染293T细胞αRelA-IP和WCE的免疫印迹分析加利福尼亚州已加载WCE总量的.5%。给出了两个独立实验的代表性数据。(d)TNF治疗与PKCζ的过度表达加利福尼亚州染色质处RelAS311ph的量增加,染色质处检测到的RelAK310me1的量减少。293T±TNF处理或±PKCζ分离的染色质富集组分的免疫印迹分析加利福尼亚州转染并用指示的抗体进行检测。给出了三个独立实验的代表性数据。(e)In-vitro公司激酶与重组PKCζ的反应加利福尼亚州对所示肽进行斑点杂交分析,并用αRelAS311ph、αRelAK310me1和αPKCζ抗体进行检测。在0.25 ug/ul下发现肽,然后进行5倍系列稀释。HRP-共轭链霉亲和素显示为一种负荷控制。显示了两个独立实验的代表性数据。(f)RelAK310me1和RelAS311ph存在于同一分子上的证据。转染组分活性PKCζ(PKCξ)的293T细胞的RelA免疫沉淀加利福尼亚州)经±CIP处理1小时,然后用指示的抗体进行探测。给出了两个独立实验的代表性数据。
图7
图7。染色质上的RelA甲基磷酸开关调节NF-κB信号
(a)PKCζ降低RelA靶基因启动子染色质对NF-κB刺激的RelAK310me1、GLP和H3K9me2占用的要求。中启动子处RelAK310me1、GLP和H3K9me2的ChIP分析普尔科茨+/+普尔科茨−/−MEF±TNF(20 ng/ml)。y轴:输入%(见图2a)。阴性对照抗体ChIP如补充图24所示。(b)依赖TNF诱导RelA靶基因表达对PKCζ的要求。左:免疫印迹分析显示PKCζ蛋白在普尔科茨−/−MEF公司。右:数量伊尔1a伊尔6通过RT-PCR分析测定所示细胞系中的mRNA±TNF(20 ng/ml)。误差条显示至少三个实验的±标准误差。

中的注释

  • 微调NF-κB:PKC-ζ的新开口。
    Moscat J,Diaz-Meco MT.公司。 Moscat J等人。 自然免疫学。2011年1月;12(1):12-4. doi:10.1038/ni0111-12。 自然免疫学。2011 PMID:21169999 免费PMC文章。

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引用人

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    1. Kouzarides T.染色质修饰及其功能。单元格。2007;128:693–705.-公共医学
    1. Albert M,Helin K。癌症中的组蛋白甲基转移酶。精液细胞开发生物学。2009年:S1084-9521。-公共医学
    1. Huang J,Berger SL.非组蛋白动态赖氨酸甲基化的新兴领域。2008年通用操作技术开发;18:152–158.-公共医学
    1. Hoffmann A、Natoli G、Ghosh G。通过NF-kappaB信号模块的转录调控。致癌物。2006;25:6706–6716.-公共医学
    1. Natoli G.通过染色质组织控制NF-kappaB依赖性转录反应。冷泉Harb Perspect生物。2009;1:a000224。-项目管理咨询公司-公共医学

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