The β-subunit of ATP synthase is involved in cellular uptake and resecretion of apoA-I but does not control apoA-I-induced lipid efflux in adipocytes

doi:10.1007/s11010-010-0650-z

.2011年2月；348(1-2):155-64.

doi:10.1007/s11010-010-0650-z。 Epub 2010年11月11日。

ATP合成酶β亚单位参与细胞对apoA-I的摄取和再分泌，但不控制apoA-I-诱导的脂肪细胞脂质流出

阿里莎·德·霍华德¹, 菲利普·维尔盖塞, 埃斯特拉·拉瑞斯, 何塞·L·苏拉盖斯

附属机构

采购管理信息： 21069432
PMCID公司：项目经理3071259
内政部： 10.1007/s11010-010-0650-z

ATP合成酶β亚单位参与细胞对apoA-I的摄取和再分泌，但不控制apoA-I-诱导的脂肪细胞脂质流出

阿里莎·德·霍华德等。分子细胞生物化学. 2011年2月.

.2011年2月；348(1-2):155-64.

doi:10.1007/s11010-010-0650-z。 Epub 2010年11月11日。

作者

阿里莎·德·霍华德¹, 菲利普·贝盖塞, 埃斯特拉·拉瑞斯, 何塞·L·苏拉盖斯

附属

¹美国俄克拉荷马州立大学生物化学与分子生物学系，美国俄克拉何马州斯蒂尔沃特74078。

采购管理信息： 21069432
PMCID公司：项目经理3071259
内政部： 10.1007/s11010-010-0650-z

摘要

细胞对apoA-I的摄取和再分泌（apoA-Irecycling）可能是决定循环血浆apoA-1和/或HDL水平的重要因素，我们最近证实了脂肪细胞对apoA-I的再循环，并认为这是一个独立于ABCA1功能的受体介导的过程。在本研究中，表明脂肪细胞的apoA-I循环可被抗ATP合成酶β亚基的单克隆抗体阻断，ATP合成素β亚基是一种以前被鉴定为apoA-1受体的蛋白质。对另外两种蛋白质（载脂蛋白和小球蛋白）的细胞循环的研究表明，载脂蛋白-I的循环是一个选择性过程。本研究还表明，阻断载脂蛋白A-I循环对载脂蛋白I-诱导的胆固醇或磷脂流出率没有影响。因此，apoA-I的细胞循环是一个选择性过程，涉及ATP合酶异位表达的β亚基。apoA-I循环的生理功能仍有待阐明。然而，这项研究表明，apoA-I的摄取和再分泌过程不是apoA-I脂质化所必需的。

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数字

图1
apoA-I、apoLp-III和Thrx的细胞再循环。用含有50μCi/ml的标记培养基培养脂肪细胞4小时[³²P] -磷酸。向细胞单层中添加含有重组pka-apoA-I（1.5 nmol）、pka-apo Lp-III（3或6 nmol）或pka-Thrx（3或6nmol）的培养基，以进行再循环分析。1小时后，收集培养基，并对样品进行SDS-PAGE和放射自显影检测蛋白质磷酸化。一显示pka-apoA-I、pka-apoSlp-III和pka-Thrx位置的代表性考马斯染色培养基样品凝胶（15%体积负载）。b凝胶的自射线照片显示[³²P] -pka重组蛋白的磷酸化。**c（c）**平均pka-apoLp-III和pka-Thrx磷酸化（以pka-apo A-I磷酸化的百分比表示）。磷酸化通过放射自显影的密度测定进行定量，并通过重组蛋白的摩尔数进行标准化。酒吧表示apoA-I的两个独立实验的平均±标准差：apoLp-III(n个=6）和apoA-I:Thrx的一个实验(n个= 4).d日体外磷酸化pka-apoA-I、pka-apoSlp-III和pka-Thrx；纯化的蛋白质与牛PKA孵育γ-[³²P] -ATP，随后通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。这个*顶部面板*显示考马斯蓝染色凝胶，而底部面板显示凝胶的放射自显影

图2
apoA-I回收的竞争实验。[³²P] -在不存在或存在pka-apoLp-III（3或6 nmol）或pka-Thrx（3或6nmol）的情况下，用pka-apoS-I（1.5 nmol）培养预标记脂肪细胞1小时。回收细胞培养基并进行SDS-PAGE和放射自显影，以评估蛋白质回收。一具有代表性的考马斯蓝染色培养基样品凝胶；b凝胶放射自显影术（来自*面板A*)显示[³²P] -pka重组蛋白的磷酸化。**c（c）**通过培养基凝胶放射自显影术测定pka-重组蛋白的平均磷酸化。酒吧代表apoA-I的两个独立实验的平均值±S.D.：apoLp-III(n个=5）和apoA-I:Thrx的一个实验(n个= 3). 研究发现，pka-apoA-I磷酸化密度之间的差异并不显著t吨-测试(*P（P）*>0.05）用于apoLpIII和Thrx竞争测定

图3
抗体对ATP合成酶的影响(β亚单位）对apoA-I的细胞再循环的影响[³²P] -在含有75μCi/ml的标记培养基中培养预标记脂肪细胞1小时[³²P] -磷酸和抗ATP合成酶β（单克隆3D5）。随后，将40μg pka-apoA-I添加到细胞培养基中，并再培养90分钟。然后，收集培养基并通过Ni亲和层析纯化apoA-I。样品在SDS-PAGE上运行，并暴露于薄膜以检测磷酸化。一代表性考马斯蓝染色凝胶；b显示纯化pka-apoA-I蛋白磷酸化的自射线照片。**c（c）**抗体浓度对pka-apoA-I磷酸化强度的影响。磷酸化强度通过蛋白质回收归一化（通过考马斯蓝染色凝胶的密度测定测定）。数据指向**c（c）**用表示平均值±S.Dn个=2–6来自两个独立实验

图4
抗ATP合成酶的作用βapoA-I依赖性磷脂外排。[³²P] -预先标记的脂肪细胞预先与不同浓度的抗ATP合成酶孵育β克隆3D5 1 h。将重组pka-apoA-I添加到细胞培养基中（最终浓度40μg/ml），培养1 h后收集培养基，并通过Ni亲和层析纯化apoA-1。然后从载脂蛋白A-I和与之相关的放射性物质中提取脂质[³²P] -通过闪烁计数测定标记磷脂。磷脂的放射性标记强度(*开放式广场*)根据apoA-I含量进行归一化。该图还显示了抗体对脂肪细胞脂肪分解率（甘油输出）的影响(*闭合正方形*).误差线代表的平均值±S.Dn个=2–6来自两个独立实验

图5
抗ATP合成酶的作用β载脂蛋白A-I诱导的胆固醇流出。一用放射标记的脂肪细胞研究胆固醇流出[^三H] -胆固醇，预先孵育1小时，添加或不添加60μg抗ATP合成酶β克隆3D5。然后将Pka-apoA-I添加到一些井中。在指定的时间点从含有apoA-I的对照孔收集流出培养基，并按照“材料和方法”一节中的说明估计胆固醇流出。数据点代表平均值±S.D(n个= 4).b流出速率(*实心钢筋*)根据中显示的时间进程计算一.ApoA-I回收(*开放式酒吧*)在同一批细胞中进行研究，但这些细胞被放射性标记为[³²P] -磷酸盐。载脂蛋白A-I循环是根据与细胞孵育1小时后从培养基中纯化的载脂蛋白A-I的磷酸化强度来确定的。样品经考马斯蓝SDS-PAGE染色分离。凝胶干燥后进行放射自显影和密度测定，以计算apoA-I磷酸化。磷酸化强度通过apoA-I含量标准化。中的数据b表示胆固醇流出的平均速率（从图中所示的斜率中获得一)以及相应的标准误差。apoA-I回收的数据表示平均值±标准差(n个= 4)

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