Role of tyrosyl-DNA phosphodiesterase (TDP1) in mitochondria

doi:10.1073/pnas.1009814107

.2010年11月16日；107(46):19790-5.

doi:10.1073/pnas.1009814107。 Epub 2010年11月1日。

酪氨酸-DNA磷酸二酯酶（TDP1）在线粒体中的作用

贝努·布拉塔·达斯¹, 托马斯·德克塞默, 卡斯图拉亚·马达利, 伊威斯·波米尔

附属公司

PMID： 21041670
预防性维修识别码： PMC2993338型
内政部： 10.1073/pnas.1009814107

酪氨酸脱氧核糖核酸磷酸二酯酶（TDP1）在线粒体中的作用

贝努·布拉塔·达斯等人。美国国家科学院程序. 2010.

.2010年11月16日；107(46):19790-5.

doi:10.1073/pnas.1009814107。 Epub 2010年11月1日。

作者

贝努·布拉塔·达斯¹, 托马斯·德克斯海默, 卡斯图拉亚·马达利, 伊威斯·波米尔

附属

¹美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心分子药理学实验室，邮编：20892-4255。

PMID： 21041670
预防性维修识别码： PMC2993338型
内政部： 10.1073/pnas.1009814107

摘要

人酪氨酸-DNA磷酸二酯酶（TDP1）水解与酪氨酸部分相连的DNA 3'末端的磷酸二酯键，并参与拓扑异构酶I（Top1）-DNA共价复合物的修复。TDP1还可以水解其他3’末端DNA改变，包括3’-磷酸乙二醇酯和3’-碱性位点，并表现出3’-核苷酶活性，表明其可能作为一般3’-末端处理DNA修复酶发挥作用。在这里，使用激光共聚焦显微镜、亚细胞分离和生化分析，我们证明了核TDP1基因编码的一部分TDP1定位于线粒体。我们还表明线粒体碱基切除修复依赖于TDP1活性，并提供证据证明TDP1是线粒体DNA氧化损伤有效修复所必需的。总之，我们的发现为TDP1作为一种新型线粒体酶提供了证据。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
TDP1定位于线粒体(A类)免疫荧光图像显示MCF-7乳腺癌细胞中TDP1（绿色）和线粒体（用MitoTracker红色标记）的共定位。细胞核用DAPI（蓝色）染色。(上部)低倍镜下TDP1的细胞分布。方框区域放大如下(下部)以更好地显示TDP1和线粒体的共定位(B类)通过活细胞显微镜定位外源性TDP1。MCF7细胞与TDP1红色荧光构建物共转染(*pTDP1-Ds红色*)和线粒体基质靶向蛋白(*pYFP-mito公司*)共聚焦显微镜下观察荧光图谱。外源TDP1和有丝分裂靶蛋白分别以红色和绿色显示。用Hoechst染色（蓝色）检测细胞核。TDP1-RED和YFP-mito的克隆化表明TDP1在线粒体中的定位。

**图2。**
线粒体提取物中的TDP1活性。(A类)线粒体提取物（ME）和MCF-7细胞核提取物（NE）中TDP1的Western blotting。50毫克ME和NE在SDS-PAGE中溶解。TDP1、核Top1、层粘连蛋白B、COX IV或TFAM的存在通过使用相应蛋白的抗体进行免疫印迹测定。COX IV或TFAM用作阳性线粒体标记物。拉明B和核Top1被用作核标记物。TDP1同时存在于NE和ME中(B类)线粒体TDP1蛋白酶不敏感性。如图顶部所示，在存在或不存在Triton-X-100的情况下，用蛋白酶K（ProK）处理MCF7细胞分离的线粒体。使用TDP1抗体制备印迹。(C类)使用单链寡肽14Y进行TDP1生化分析的示意图。³²P-放射性标记（*）位于寡肽的5′末端。TDP1催化3′-磷酸酪氨酸键的水解，并将14Y转化为带有3′-磷酸盐的寡核苷酸，14P。(D类)显示MCF7细胞核提取物（NE）和线粒体提取物（ME）中TDP1活性的代表性凝胶。使用了相同的提取物，如(A类). 调整NE和ME以获得相同的蛋白质浓度（2μg/μL）。在TDP1生化分析中测试了系列稀释液（3倍）。(E类)线粒体酪氨酸-DNA磷酸二酯酶活性依赖于TDP1。ME由TDP1+/+和TDP1−/−MEFs细胞生成，并进行调整以获得相同的蛋白质浓度（1.5μg/μL）。在TDP1生化分析中测试了一系列稀释液（3倍）。14P：与预期产物相对应的寡核苷酸标记，其在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的运行速度比相应的酪氨酸寡核苷酸底物（14Y）更快。

**图3。**
线粒体碱基切除修复依赖于TDP1和DNA连接酶III(A类)体外修复分析的示意图。缺口DNA底物是通过将5′端放射性标记的14-Y寡核苷酸或14-G寡核苷酸与36米的底部链和22米的顶部链退火而生成的。TDP1催化3′-磷酸酪氨酸（14-Y）或3′-磷酸酯（14-G）转化为带有3′-磷酸盐（14-P）的寡核苷酸，该寡核苷酸由磷酸酶进一步加工为3′-羟基产物（14-OH）。DNA连接酶III生成最终修复产物（36）。TDP1-和连接酶III介导MCF-7细胞线粒体提取物（ME）的修复活性。(B类)用含有3′-磷酸酪氨酸（14-Y）的双链缺口DNA底物培养两微克ME免疫缺失（ID）和对照IgG（ID-IgG，第3道）或TDP1（ID-TDP1，第4道）或连接酶III（ID-LigIII，第5道）(A类,上部). 如图所示，通道2对应于含有不含（−）ME的3′-磷酸酪氨酸（14-Y）的DNA底物。25岁时进行反应 °C持续30分钟。的位置[γ-³²P] -显示了与维修产品36（第6通道）和维修中间体（第14-P和14-OH，第1通道）相对应的标记。C类)带有对照IgG（ID-IgG，*车道5*)或TDP1（ID-TDP1，泳道6）或连接酶III（ID-LigIII，泳道7）与含有3′-磷酸乙醇酸酯（14-G）的双链有缺口的DNA底物一起孵育。通道4对应于含有不含ME的3′-磷酸乙二醇酯（14-G）的DNA底物。反应在25 °C持续2小时。的位置[γ-³²P] -显示了与维修产品36（车道1）和维修中间产物（14-P，车道2和14-OH，车道3）相对应的标记。

**图4。**
TDP1−/−细胞的线粒体在修复氧化性DNA损伤方面存在缺陷。(A类,B类)差速器H₂O（运行）₂-诱导TDP1+/+和TDP1−/−细胞线粒体DNA损伤。采用长程定量PCR评价线粒体DNA损伤。A组显示了不同剂量的H后mtDNA长程扩增（10 kbp）和短程扩增（117 bp）的代表性凝胶₂O（运行）₂持续4小时。扩增线粒体DNA 117 bp片段以监测线粒体基因组的拷贝数。(B类)定量10 kb mtDNA片段的相对PCR扩增归一化为mtDNA拷贝数。(C类,D类)H的时间进程₂O（运行）₂-诱导TDP1+/+和TDP1−/−细胞线粒体DNA损伤。用2 mM H处理细胞₂O（运行）₂对于指定的时间段。(C类)显示10 kbp和117 bp mtDNA片段PCR扩增的代表性凝胶。(C类)定量10 kb mtDNA片段的相对PCR扩增归一化为mtDNA拷贝数。数据表示独立实验的平均值±标准误差。

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1. Chen H等。线粒体融合是骨骼肌线粒体DNA稳定性和线粒体DNA突变耐受性所必需的。单元格。2010;141:280–289.-项目管理委员会-公共医学
1. Richter C、Park JW、Ames BN。线粒体和核DNA的正常氧化损伤是广泛的。美国国家科学院院刊，1988年；85:6465–6467.-项目管理委员会-公共医学
1. Yakes FM，Van Houten B.线粒体DNA损伤比氧化应激后人类细胞的核DNA损伤更广泛，持续时间更长。美国国家科学院院刊1997；94:514–519.-项目管理委员会-公共医学
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