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.2011年1月7日；286(1):491-501.
doi:10.1074/jbc。M110.167148。 Epub 2010年11月1日。

Bim和Bid以外的BH3结构域可以直接激活Bax/Bak

韩杜 1, 雅各布·沃尔夫, 布兰卡·谢弗, 都铎·莫尔多瓦努, 杰里·齐普克, 库瓦纳（Tomomi Kuwana）
附属公司

除Bim和Bid之外的BH3域可以直接激活Bax/Bak

韩杜等。 生物化学杂志. .

摘要

Bcl-2家族蛋白调节细胞凋亡的关键步骤，称为线粒体外膜通透性（MOMP）。Bcl-2家族的一个亚群（称为BH3-only蛋白）的成员激活促凋亡效应器（Bax和Bak）以启动MOMP。它们通过中和促生存Bcl-2蛋白和/或直接激活Bax/Bak来实现这一目的。据报告，Bim和Bid是直接激活者；然而，这里我们显示，除Bim和Bid外，BH3肽对效应器Bax或Bak表现出不同程度的直接激活，包括Bmf和Noxa BH3。在缺乏有效的直接激活剂（如Bim和Bid）的情况下，我们发现了新的直接激活物BH3配体，能够诱导效应介导的细胞色素c释放和脂质体渗透，即使Bcl-xL-和Mcl-1型抗凋亡蛋白都受到抑制。这些较弱的直接激活物BH3肽导致MOMP的能力与相应全长蛋白在缺乏Bim和Bid的情况下诱导凋亡的能力相关。我们认为，在某些情况下，除Bim和Bid外，BH3蛋白的直接激活可能会显著促进MOMP和凋亡。

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数字

图1。
图1。
细胞色素c（c）BH3配体从Bim/Bid DKO MEF中释放。 A类，本研究中使用的BH3肽（人类）的氨基酸序列。B用洋地黄素渗透Bim/Bid DKO MEF，并用裂解的Bid蛋白孵育(N/C投标)或BH3肽。Bim BH3肽具有最强的细胞色素c（c）释放活性；在较高浓度下，Bid、Bmf和Puma BH3肽也有一些活性。印迹是三个独立实验的代表。C类，50μ时的BH3肽米没有释放细胞色素c（c）因此，即使在50μ米，细胞色素c（c）BH3肽释放，如B依赖Bax/Bak。细胞色素证实了洋地黄素的通透性c（c）在Bax（480 n）的对照中观察到的释放米)和N/C标（45 N米)已添加。D类从CHAPS或Nonide P-40溶解的Bim/Bid DKO MEF中免疫沉淀Bcl-xL、Bcl-2和Mcl-1，并探测Bax或Bak。L（左）、裂解物或上清液；B，珠子。在使用两种洗涤剂的细胞中，Bax和Bak均与Bcl-xL或Bcl-2无关。Bax与Mcl-1无关，而～10–15%的Bak与Mcl-1结合，根据凝胶上装载7.5%的裂解物和50%的珠样这一事实估计（另见图6，B和C类).E类在WT MEF和Bim/Bid DKO MEF中检测到Bcl-2蛋白。蛋白质以50μg每车道装载，并使用特定抗体通过免疫印迹检测。肌动蛋白的免疫印迹证实了负载量相等(底部面板). 在WT MEF或DKO MEF中均未检测到彪马（数据未显示）（27）。在DKO中几乎检测不到Bmf。没有适合检测小鼠Noxa的抗体。在这些细胞中，一些不同的抗体无法检测到Bad（数据未显示）。另一种抗凋亡Bcl-2蛋白A1的mRNA在MEF中不存在（29）。WT MEF表达类似水平的Bax和Bak，这是根据分别使用重组Bax和cBak的标准估计的。Bim/Bid DKO MEF中的Bak和Bcl-2水平低于WT中的水平。
图1。
图1。
细胞色素c（c）BH3配体从Bim/Bid DKO MEF中释放。 A类，本研究中使用的BH3肽（人类）的氨基酸序列。B用洋地黄素渗透Bim/Bid DKO MEF，并用裂解的Bid蛋白孵育(N/C投标)或BH3肽。Bim BH3肽具有最强的细胞色素c（c）释放活性；在较高浓度下，Bid、Bmf和Puma BH3肽也有一些活性。印迹是三个独立实验的代表。C类，50μ时的BH3肽米没有释放细胞色素c（c）因此，即使在50μ米，细胞色素c（c）BH3肽释放，如B依赖Bax/Bak。细胞色素证实了洋地黄素的通透性c（c）在Bax（480 n）的对照中观察到的释放米)和N/C标（45 N米)已添加。D类从CHAPS或Nonide P-40溶解的Bim/Bid DKO MEF中免疫沉淀Bcl-xL、Bcl-2和Mcl-1，并探测Bax或Bak。L（左）、裂解物或上清液；B，珠子。在使用两种洗涤剂的细胞中，Bax和Bak均与Bcl-xL或Bcl-2无关。Bax与Mcl-1无关，而～10–15%的Bak与Mcl-1结合，根据凝胶上装载7.5%的裂解物和50%的珠样这一事实估计（另见图6，B和C类).E类在WT MEF和Bim/Bid DKO MEF中检测到Bcl-2蛋白。蛋白质以50μg每车道装载，并使用特定抗体通过免疫印迹检测。肌动蛋白的免疫印迹证实了负载量相等(底部面板). 在WT MEF或DKO MEF中均未检测到彪马（数据未显示）（27）。在DKO中几乎检测不到Bmf。没有适合检测小鼠Noxa的抗体。在这些细胞中，一些不同的抗体无法检测到Bad（数据未显示）。另一种抗凋亡Bcl-2蛋白A1的mRNA在MEF中不存在（29）。WT MEF表达类似水平的Bax和Bak，这是根据分别使用重组Bax和cBak的标准估计的。Bim/Bid DKO MEF中的Bak和Bcl-2水平低于WT中的水平。
图2。
图2。
重组cBak可渗透脂质体膜和线粒体。 A类，本地Bak和cBak的示意图。重组cBak缺乏N端15个氨基酸和C端25个氨基酸。B用荧光素孵育、cBak、N/C-Bid和Bcl-xL(F类)-右旋糖酐脂质体，如前所述测量右旋糖苷释放（13）。脂质体通过上浮离心回收，并通过免疫印迹法检测与膜相关的Bak。N/C-Bid促进了cBak与膜的结合，Bcl-xL阻断了这种作用。脂质体通透性与膜中cBak的含量相关。所示斑点代表五个实验。C类，N/C-Bid诱导膜中cBak的低聚。图2中中间通道的cBak和N/C-双体积脂质体B在2%CHAPS中溶解并通过凝胶过滤进行分级(N/C-处理的投标). 作为对照，在没有劈开Bid的情况下与脂质体孵育的总cBak被分馏并发现是单体的(未经处理).D类cBak与不含Bax和Bak的小鼠肝线粒体孵育。Bim、Bid和Bmf BH3肽刺激了强健的细胞色素c（c）释放，Hrk、Puma和Bik BH3显示出适度释放(上部面板). 检测到cBak低聚物(下部面板). 注意细胞色素c（c）释放与cBak低聚物的形成密切相关。E类，BH3肽（25μ米)添加到从野生型小鼠肝脏分离的线粒体中。细胞色素图谱c（c）与BH3肽结合的天然Bak的释放反应与与BH3多肽结合的cBak相似；Bim和Bid BH3的效力很强，Bmf和Puma BH3也持续触发适度释放。我们使用小鼠BH3肽进行Bid和Bmf，其余为人BH3。
图3。
图3。
BH3配体对Bax和cBak的活化显示出低级直接活化。 A类BH3肽本身不会触发脂质体渗透。Bax（120牛顿）米)，N/C投标（45 N米)或BH3肽（25μ米)添加到含有荧光素的脂质体中(F类)-右旋糖酐（10 kDa）。B和C类，通过一组BH3肽直接激活Bax或cBak。直接Bax激活的效力将Bim BH3列为最强激活剂，其次是Bid、Bmf和Noxa BH3为中度激活剂，Bik、Hrk和Puma BH3为弱激活剂，Bad BH3为非激活剂。D类背景释放差异（Bax单独释放；黑条)不会导致错误的直接激活。坏的BH3肽始终无法直接激活Bax(灰色条)Bax alone诱导的渗透范围（8-42%）。E类右旋糖酐释放的时间过程表明，Bmf和Noxa BH3的直接激活程度较低(上部面板)以及Bik、Hrk和Puma BH3(下部面板). Bim和Bmf BH3肽都包含在这两种分析中，以显示肽之间的相对效力。弱直接活化剂诱导的通透性缓慢，但明显高于Bax单独背景，这与终点分析一致。F类，CD证实本研究中使用的所有BH3肽在10 m处发生了内在紊乱米pH 7.0的磷酸盐缓冲液。Bik BH3在水溶液中的溶解度较差，需要在CD样品中使用0.1%的二甲基亚砜，这在200 nm以下的数据中引入了显著的噪声。虽然Bim和Noxa BH3肽明显溶解在水中，但它们在CD缓冲液中的溶解性可能较低，如200 nm处的椭圆度下降不太明显。
图4。
图4。
当抗凋亡蛋白被抑制时，BH3配体显示直接激活。 A类在有Bcl-xL存在的情况下，Bax被与没有Bcl-xL的情况下相同的BH3肽组激活，但Noxa BH3无效。B表示此情况已在以下小组中解决，B.B类，坏的BH3肽可能消除了Bcl-xL抑制，揭示了Noxa BH3对Bax的直接激活。C类在Bcl-xL存在下，cBak仅被Bim和Bmf BH3激活。D类和E类表示这些情况在以下小组中得到了解决，D类和E类分别是。D类，不良BH3干扰了Bcl-xL，揭示了投标BH3对cBak的直接激活。E类，Bad BH3抑制了Bcl-xL，揭示了Noxa BH3对cBak的直接激活。F类和G公司在存在Mcl-1的情况下，Bax和cBak被相同的肽直接激活，这些肽在没有Mcl-1时直接激活它们，但Puma BH3在这两种情况下都表现出更强的直接激活能力，Noxa BH3未能激活cBak。
图5。
图5。
BH3配体通过脂质体中的抗凋亡药物克服效应抑制。 A类，Bax含量高(左侧面板)或cBak(右侧面板)导致脂质体显著渗透，Bcl-xL或Mcl-1以剂量依赖的方式抑制了这种渗透。BBad BH3及其类似物ABT 737都能够干扰Bcl-xL或Mcl-1对Bax或cBak的抑制。
图6。
图6。
Mcl-1的Bak分离与细胞色素相关c（c）在渗透细胞中释放。 A类，细胞色素c（c）Bim/Bid DKO MEF中线粒体的释放，如图1所示。在50μ米用于免疫沉淀研究的洋地黄素渗透Bim/Bid DKO MEF，其结果如B和C类Noxa和Bad BH3肽的结合触发了细胞色素c（c）发布，如前所述。BMcl-1抗体免疫沉淀后上清液中Mcl-1和Bak的作用。细胞颗粒A类与肽孵育后溶解在1%CHAPS中，进行免疫沉淀。Mcl-1从裂解物中被耗尽。在印迹上无法检测到Bak水平的降低，可能是因为只有～10-15%的Bak是免疫共沉淀的。C类，与Mcl-1的Bak免疫共沉淀与细胞色素呈负相关c（c）释放；与Bak相关的Mcl-1越少，细胞色素越多c（c）已发布。D类，BH3-only蛋白过度表达诱导的细胞凋亡与细胞色素相关c（c）BH3肽诱导的释放。我们使用了小鼠基因，但Bmf是人类基因。根据基于FACS的同一质粒IRES驱动GFP表达的测量，样品间的转染效率具有可比性。此图中的所有数据都是3-7个实验的代表。
图7。
图7。
Bcl-2家族蛋白质相互作用概述。我们认为BH3-only蛋白、抗凋亡蛋白和Bax/Bak之间存在三种相互作用。A类，当Bcl-xL-和Mcl-1型抗凋亡Bcl-2蛋白被抑制，Bax/Bak被直接激活时，MOMP产生。仅BH3蛋白取代仅激活剂BH3蛋白和/或Bax/Bak。B，即使所有抗凋亡蛋白被抑制，Bax/Bak被释放，Bax/Bak仍需要在MOMP发生前被直接激活。C类，仅抑制一种生存前Bcl-2蛋白不足以诱导MOMP。
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