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.2010年10月29日；33(4):583-96.
doi:10.1016/j.immuni.2010.09.010。 Epub 2010年10月7日。

Rab11a GTPase控制Toll样受体4诱导的干扰素调节因子-3在吞噬体上的激活

哈拉尔德·侯赛比 1, 玛丽·赫杰姆塞斯·奥恩, 约根·斯坦维克, 艾文德·桑斯塔德, 弗罗德·斯科耶达尔, 奥文德·哈拉斯, 纳德拉·J·尼尔森, 哈拉尔德·斯坦马克, 艾克·拉茨, 埃吉尔留置权, 汤姆·艾里克·莫尔内斯, 奥德蒙德·巴克, 泰耶·埃斯佩维克
附属公司

Rab11a GTPase控制Toll样受体4诱导的干扰素调节因子-3在吞噬体上的激活

哈拉尔德·侯赛比等。 免疫. .

摘要

Toll样受体4（TLR4）对革兰氏阴性菌的识别是必不可少的。我们描述了TLR4从内吞再循环室（ERC）向大肠杆菌吞噬体的转运途径。我们发现在ERC中TLR4和小GTPase Rab11a之间有一个显著的共定位，并且在需要TLR4信号的过程中，Rab11b参与TLR4向吞噬体的招募。此外，定位于大肠杆菌吞噬体的Toll-receptor相关分子（TRAM）和干扰素调节因子-3（IRF3）以及大肠杆菌的内化也需要干扰素-β的诱导。抑制Rab11a可降低ERC和吞噬体中的TLR4，从而抑制大肠杆菌诱导的IRF3信号通路，而转录因子NF-κB的激活不受影响。此外，Rab11a沉默降低了吞噬体上TRAM的数量。因此，Rab11a是TLR4和TRAM向大肠杆菌吞噬体转运的重要调节器，从而控制来自该隔室的IRF3激活。

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数字

图1。
图1.Rab11a阳性ERC在HEK293 TLR4中含有大量TLR4YFP公司单元格
通过共聚焦显微镜在固定细胞上获得正交和平面投影数据。重叠区域在重叠面板中显示为黄色。（A） HEK293-TLR4的正交投影YFP公司共表达与CFP（β−1,4 GT）相关的反式介导高尔基标记物β−1，4半乳糖基转移酶的细胞CFP公司). （B） HEK293-TLR4的平面截面YFP公司通过Rab11a抗体（ab3612）对细胞进行内源性Rab11a染色。（C） 顺高尔基体（GM130）TLR4的三维建模YFP公司和Rab11aCFP公司在HEK293-TLR4中YFP公司Rab11a共转染细胞CFP公司、MD-2和CD14。（D和E）HEK-TLR4樱桃显性阴性GDP-结合的Rab11aSN共转染细胞GFP公司（D） 或本构活性GTP结合的Rab11aQLGFP公司（E） 以及MD-2和CD14。比例尺表示10μm。数据是四个独立实验的代表。另请参见图S1。
图2。
图2.Rab11a-阳性ERC在人单核细胞中含有大量TLR4
用共焦显微镜在固定细胞上获得正交和平面投影数据。重叠区域在覆盖面板中显示为黄色。（A） 人单核细胞TLR4和跨介质高尔基体（高尔基-97）的正交投影。（B） 人类单核细胞对TLR4和Rab11a进行共染色。比例尺表示10μm。数据是三个独立实验的代表。另请参见图S2。
图3。
图3.TLR4和Rab11a在吞噬细胞周围积聚大肠杆菌，但周围没有金黄色葡萄球菌
人类单核细胞与大肠杆菌或金黄色葡萄球菌颗粒（5.0×106/ml）15分钟，固定并染色TLR4或Rab11a。重叠区域在重叠面板中显示为黄色。（A） TLR4向大肠杆菌吞噬体。TLR4（绿色），大肠杆菌（红色）和叠加（右侧）。（B） TLR4不会向金黄色葡萄球菌吞噬体。TLR4（绿色），金黄色葡萄球菌（红色）和叠加（右侧）。（C） Rab11a向大肠杆菌吞噬体。Rab11a（绿色），大肠杆菌（红色）和叠加（右侧）。（D） Rab11a不会向金黄色葡萄球菌吞噬体。Rab11a（绿色），金黄色葡萄球菌（红色）和叠加（右侧）。比例尺表示10μm。数据是三个独立实验的代表。另请参见图S3。
图4。
图4.添加大肠杆菌致人单核细胞TLR4和Rab11a的细胞内再分布
人类单核细胞与大肠杆菌颗粒（2×106/ml），固定，并对TLR4或Rab11a进行免疫染色。（A） 有或无培养细胞中ERC的TLR4体素强度大肠杆菌测量15分钟（p=0.001）。（B） 有或无孵育细胞ERC中的Rab11a体素强度大肠杆菌持续15分钟（p<0.0001）。（C） 启用TLR4体素强度大肠杆菌吞噬体与孵育时间的关系（TLR4在15分钟到30+30分钟之间p<0.0001）。（D） Rab11a体素强度打开大肠杆菌吞噬体与孵育时间的关系（Rab11a从15分钟到30+30分钟的p=0.046）。图中的条形代表中间值。n=观察次数。数据是三个独立实验的代表。另请参见图S4和电影S1。
图5。
图5.TLR4的招募大肠杆菌噬菌体需要TLR4信号和完整的肌动蛋白丝，但不需要动力蛋白
用细菌颗粒培养的人单核细胞，固定并免疫染色TLR4、TRAM和MyD88；以正常兔IgG为对照抗体。（A） 吞噬体对TLR4的补充需要TLR4信号。与对照抗体染色的细胞相比，TLR4免疫染色的细胞中吞噬体TLR4体素强度增加了一倍。用热灭活培养细胞30分钟鼠疫耶氏菌(2 × 106/ml）在26°C或37°C下培养。（B） 启用TRAM体素强度大肠杆菌吞噬体（p<0.0001）。（C） 启用IRF3体素强度大肠杆菌吞噬体。从30分钟到30+30分钟，观察到IRF3增加（p<0.0028）。（D） TLR4招募至大肠杆菌吞噬体需要完整的肌动蛋白丝。用2μM细胞松弛素D（细胞D）或载体（DMSO）预处理细胞30分钟，并用大肠杆菌在抑制剂或载体存在下保持30分钟（p<0.0001）。（E） TLR4招募至大肠杆菌吞噬体独立于高尔基体发生。用5μg/ml Brefeldin A或载体（DMSO）预处理细胞，并用大肠杆菌在抑制剂或载具存在的情况下。（F） 抑制动力蛋白不会导致吞噬体TLR4减少。在无血清条件下培养单核细胞2小时，并用调理液处理30分钟大肠杆菌。随后，将细胞清洗两次，并在无血清培养基中用80μM Dynasore或载体（DMSO）培养30分钟（DMMO和Dynasole处理的p=0.0002）。单核细胞与大肠杆菌颗粒（3.0–8.0×106/ml）（B–F）。图中的条形代表中间值。n=观察次数。数据是三个独立实验的代表。另请参见图S5。
图6。
图6。。大肠杆菌-诱导的IFN-β信号传导需要吞噬作用，TLR4募集到吞噬体是Rab11a依赖性的
（A和B）用不同浓度的大肠杆菌颗粒或LPS。干扰素-β和肿瘤坏死因子mRNA的数量由QPCR测定，并表示为相对于非刺激单核细胞的平均值和标准偏差。（C和D）刺激单核细胞中IFN-β（C）和TNF mRNA（D）的诱导大肠杆菌颗粒（8.0×106/ml）或LPS（100 ng/ml）孵育60分钟。通过与或不与人A+血清孵育，或与预调理以及吞噬抑制剂细胞D或载体（DMSO）孵养，检查吞噬作用的影响。干扰素-β和肿瘤坏死因子mRNA的数量由QPCR测定，并表示为相对于非刺激单核细胞的平均值和标准偏差。（E） HEK293-TLR4型YFP公司用非沉默RNA寡核苷酸（NS RNA）或Rab11a-siRNA处理细胞或人单核细胞，制备细胞裂解物，并用Rab11a抗体（ab3612）或Rap7a抗体进行免疫印迹。GAPDH用于控制等负荷。（F） TLR4的共焦图像YFP公司HEK293-TLR4中的（绿色）YFP公司细胞共存β−1,4 GTCFP公司（红色）用NS RNA（左）或Rab11a siRNA（右）处理。箭头指示高尔基环的中心。（G）TLR4打开大肠杆菌用NS RNA或Rab11a siRNA处理单核细胞中的吞噬体，并用大肠杆菌颗粒（3×106/与Rab11a siRNA处理的细胞相比，分别在15分钟和30分钟时，NS RNA中TLR4的数量分别为0.05和0.03 ml）。（H） TRAM开启大肠杆菌NS RNA或Rab11a siRNA刺激的单核细胞吞噬体大肠杆菌颗粒（3×106/ml），与siRNA处理的细胞相比，NS-RNA中TRAM数量p=0.02。图中的条形代表中间值。n=观察次数。数据是四个独立实验的代表。比例尺代表5μm。另请参见图S6。
图7。
图7 Rab11a沉默选择性影响TLR4-介导的IRF3激活和IFN-β诱导
（A和B）用NS RNA或siRNA处理人类单核细胞（48小时），并用大肠杆菌如图所示，颗粒（A）或LPS（B）。使用识别磷酸化IRF3（Ser 396）和总IRF3的IRF3抗体进行免疫印迹。α-管蛋白被用作等负荷对照。siRNA处理的单核细胞（C）和HEK293TLR4中的（C和D）IkB-α降解YFP公司细胞（D）受刺激大肠杆菌颗粒（1.0×107/ml），GAPDH作为负载对照。（E和F）HEK293 TLR4樱桃用siRNA或NS RNA处理72小时的细胞，铺板并用MD-2、CD14和Gal4-IRF3-萤光素酶报告基因（E）或NF-κB萤光素酶报告基因（F）转染。细胞与大肠杆菌或LPS治疗9小时。Gal4-IRF3激活归一化为Renilla荧光素酶。激活表示为Gal4DBD信号的平均相对荧光素酶单位（RLU）和标准偏差。（G和H）用NS RNA或siRNA处理的人单核细胞，并用大肠杆菌(3.0 × 106/ml），并对总IRF3（G）或总p65（H）进行固定和免疫染色。核IRF3（G）的量化。与NS RNA处理的细胞相比，沉默Rab11a导致核IRF3易位减少（15分钟；p=0.0145,30分钟；p=0.0009）。核p65（H）的定量。沉默Rab11a导致30分钟时核p65易位增加（p=0.0031）。条形代表中间值。n=观察次数。比例尺表示10μm。（I和J）用NS RNA或siRNA处理人类单核细胞20小时后，用大肠杆菌颗粒（3.0×106/ml）。分离总RNA，通过QPCR量化IFN-β和TNF mRNA水平，显示为相对于参考样品（NS RNA，0 min）的平均值和标准偏差。数据是三个独立实验的代表。另请参见图S7。
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