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.2010年12月10日；285(50):38944-50.
doi:10.1074/jbc。M110.160325。 Epub 2010年10月1日。

Plk3通过HIF-1α的直接磷酸化发挥缺氧调节途径的重要组成部分的作用

徐大众 1, 姚一欣, 罗璐, 马克斯·科斯塔, 魏代
附属机构

Plk3通过HIF-1α的直接磷酸化发挥缺氧调节途径的重要组成部分的作用

徐大众等。 生物化学杂志. .

摘要

Polo-like kinase 3（Plk3）在调节细胞周期进程和应激反应中起着重要作用。随着衰老的Plk3-null小鼠在多个器官发生肿瘤，Plk3也具有肿瘤抑制活性。PLK3-null小鼠中高血管化肿瘤的生长表明，PLK3在血管生成和细胞对缺氧的反应中发挥作用。通过研究原代等基因小鼠胚胎成纤维细胞，我们验证了Plk3在缺氧信号通路中发挥作用的假设。PLK3（-/-）小鼠胚胎成纤维细胞在缺氧条件下HIF-1α水平升高。免疫沉淀和下拉分析表明，在缺氧条件下，Plk3与HIF-1α发生物理相互作用。纯化的重组Plk3，但不是激酶缺陷突变体，在体外磷酸化HIF-1α，导致迁移率发生重大变化。质谱鉴定出两种独特的丝氨酸残基被Plk3磷酸化。此外，环己酰亚胺或脉冲追逐处理后的异位表达表明，磷酸突变体的半衰期比野生型突变体长得多，这有力地表明Plk3在体内直接调节HIF-1α的稳定性。综上所述，我们的研究确定了Plk3是调节缺氧信号通路的一个新的和重要的参与者。

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数字

图1。
图1。
Plk3在功能和物理上与HIF-1α相互作用。 A类，成对的野生型(W公司)以及第3页纯合子被破坏(H（H）)用氯化镍处理MEF2，一种缺氧模拟物，持续不同时间。对等量的蛋白裂解物进行HIF-1α和β-肌动蛋白印迹。显示HIF-1α多泛素化形式。B类用Plk3 IgG或对照IgG免疫沉淀等量的细胞裂解物。洗涤后，免疫沉淀物和裂解物输入物被印迹HIF-1α和Plk3。NS公司表示非特异性带。C类，重组His6-将Plk3固定在Ni-NTA树脂上。伊斯6-Plk3树脂以及对照(碳纳米管)树脂，与暴露于缺氧应激的A549细胞的等量裂解物孵育。在彻底清洗后，结合到任一树脂的蛋白质以及裂解物输入被吸出HIF-1α。NS公司表示非特异性带。
图2。
图2。
Plk3磷酸化HIF-1α在体外. A类，重组His6-Plk3表达于第9部分细胞并使用Ni-NTA亲和性方法进行纯化，如“实验程序”所述。使用第9部分对照细胞裂解物。净化了他的6-考马斯蓝染色证实了Plk3。B类,第9部分感染或不感染His的细胞裂解物6-Plk3杆状病毒和洗脱蛋白用Plk2抗体进行了印迹。C类，在补充有[γ-32P] ATP。图中显示了典型的自动放射自显影。D类,在体外在[γ]存在的情况下进行激酶分析-32P] ATP以及所示的各种组件。麦汁代表沃特曼。图中显示了典型的自动放射自显影。
图3。
图3。
Plk3磷酸化Ser上的HIF-1α576和Ser657. A类，Plk3和Plk3-K91R均在Sf9细胞中表达，并使用NTA-Ni树脂纯化。测定纯化的Plk3和Plk3-K91R对HIF-1α的激酶活性在体外在含有[γ]的激酶缓冲液中-32P] ATP。图中显示了典型的自动放射自显影。B类如图所示，在存在各种成分的情况下进行激酶分析。反应后，用SDS-PAGE对样品进行分析，然后用考马斯蓝染色。一条“热门”样本通道(自动放射自显影上左边)图中还显示了在同一凝胶上运行的。C类，HIF-1α序列表示显示丝氨酸磷酸化位点Ser的相对位置576(上部面板)和Ser657(下部面板)HIF-1α结构域。ODDD公司，氧依赖降解域；N-TAD公司，N端交易激活域；NES公司核出口信号；荷兰统计局，核定位信号；C-TAD公司，C终端交易激活域。核出口信号下部面板突出显示为下划线.序列号641和Ser643已知被ERK磷酸化。D类，氨基酸序列显示了来自Plk3靶向区域不同物种的HIF-1α分子。保守的丝氨酸残基是突出显示的.
图4。
图4。
Plk3对HIF-1α的磷酸化导致其失稳。 A类图中显示了用于转染分析的HIF-1α及其突变体（磷酸化和/或羟基化突变体）的示意图。B类，HEK293细胞与各种表达结构共同转染，如C类，并提出了一种GFP表达构建，用于1天转染效率的标准化。对等量的细胞裂解物进行HIF-1α、Akt1、GSK3β、GFP和β-肌动蛋白的蛋白质印迹。C类，中显示的信号B类用密度计定量。
图5。
图5。
与野生型HIF-1α相比，Plk3磷酸化抗性突变体的半衰期更长。 A类用HA标记的HIF-1α表达构建物或表达Plk3磷酸化抗性突变体的构建物（HA-HIF-1α-S576A、HA-HIF1α-S657A或HA-HIF-α-S576/S657A）或载体转染HEK293细胞1天。然后用环己酰亚胺处理转基因细胞(瑞士法郎)如所指示的不同时间。使用抗HA标签抗体对来自每个治疗点的等量细胞裂解液进行印迹，以检测外源性表达的HIF-1α蛋白。B类，HIF-1α及其突变蛋白信号A类通过密度扫描定量，并从三个独立的实验中总结数据。
图6。
图6。
Plk3作为HIF-1α调节网络的一部分发挥作用。 A类，将转染HA-HIF-1α或HA-HIF-2α-S576A/S657A的HEK293细胞脉冲[35S] 蛋氨酸/半胱氨酸0.5h，然后在无同位素培养基中进行不同时间的chase。收集HEK293细胞进行裂解液制备。用抗HIF-1α抗体免疫沉淀来自不同处理的等量裂解物。免疫沉淀物在SDS变性凝胶上分离，然后进行放射自显影。HIF-1α特异性信号经密度测定合格，并对数据进行了总结。B类提出了一个模型来说明Plk3如何调节缺氧反应网络。绿色箭头表示正向调节；红色条表示负调控。
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