跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2010年12月15日；19（24）：4861-70。
doi:10.1093/hmg/ddq419。 Epub 2010年9月24日。

线粒体吞噬诱导后，线粒体融合蛋白1和线粒体融合蛋白2以PINK1/parkin依赖的方式泛素化

马修·盖格 1, J马克·库珀, 凯音洲, 曼努埃尔·罗霍, 安东尼·H·V·夏皮拉, 詹·威勒姆·塔曼
附属公司

线粒体吞噬诱导后，线粒体融合蛋白1和线粒体融合蛋白2以PINK1/parkin依赖的方式泛素化

马修·盖格等。 人类分子遗传学. .

勘误表in

  • 人类分子遗传学。2013年4月15日；22(8):1697

摘要

线粒体功能障碍和蛋白质的紊乱降解与帕金森病（PD）的发病机制有关。Parkin和PINK1基因的突变是家族性PD的一个原因。PINK1是一种与线粒体相关的假定激酶，PINK2表达的缺失会导致线粒体功能障碍，并随着时间的推移而增加。Parkin被认为是PINK1的下游，也通过大自噬（线粒体自噬）介导受损线粒体的去除。我们研究了RNAi降低PINK1表达后多巴胺能SH-SY5Y细胞的线粒体功能障碍是否部分是由于有丝分裂受到抑制。在PINK1沉默12天后，通过宏观自噬途径的流量减少与ATP合成的抑制相一致。这些细胞中parkin的过度表达恢复了自噬流量和ATP合成。过度表达和RNAi研究也表明，在CCCP诱导的线粒体损伤后，PINK1和parkin是线粒体吞噬所必需的。在CCCP治疗的3小时内，检测到一些线粒体蛋白的泛素化，包括线粒体融合蛋白1和线粒体融合蛋白2。帕金或PINK1沉默后，这些翻译后修饰减少。线粒体蛋白的泛素化似乎可以识别线粒体的降解并促进有丝分裂。因此，PINK1和parkin是去除多巴胺能细胞中受损线粒体所必需的，并且该途径的抑制可能导致缺陷线粒体的积累，这可能有助于PD的发病机制。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
PINK1沉默12天后ATP合成和自噬通量。将PINK1 siRNA#2或对照siRNA转染SH-SY5Y细胞或Park OE细胞12天。(A类)通过胰蛋白酶化法获取细胞，用洋地黄素渗透，并在37°C下与谷氨酸+苹果酸（复合物I、III、IV）、琥珀酸+鱼藤酮（复合物II、III、Ⅳ）或抗坏血酸+TMPD（复合物IV）孵育，以测量ATP合成。ATP通过荧光素酶测定测定，并归一化为细胞数。数据表示为对照siRNA ATP合成百分比（平均值±SEM；n个= 5). *P（P）与对照siRNA相比<0.05(B类)从未经处理的细胞（基底细胞）或用溶酶体抑制剂E64d和胃蛋白酶抑制素A（均为10μg/ml）处理3 h的细胞制备细胞裂解物。用LC3抗体检测蛋白质印迹，用抗β-肌动蛋白抗体评估等蛋白载量。测量条带密度，并将LC3-II/LC3-I比率归一化为β-肌动蛋白。数据表示为基础条件下或存在溶酶体抑制剂时对照siRNA处理细胞系的百分比(n个= 5). *P（P）与基础条件下ParkSH+siRNA相比，<0.05。
图2。
图2。
CCCP诱导的有丝分裂需要parkin和PINK1的表达。(A类)含有空载体（SH）或Park OE细胞的SH-SY5Y细胞用载体[0.05%（v/v）乙醇]或10μ米评估CCCP、裂解物和CS活性。数据表示为载体处理细胞的%CS活性（平均值±SEM；n个= 5). *P（P）<0.05与车辆和**P（P）与车辆相比<0.01。(B类)用载体或CCCP处理细胞24 h，用western blot检测细胞裂解和线粒体蛋白表达（TFAM，MTCOII）。通过检测GAPDH评估等负荷。四个单独实验的印迹代表。(C类)正常SH-SY5Y细胞（对照组）、parkin KD细胞或Park OE细胞用载体或CCCP处理16 h，裂解并测定CS活性。数据表示为nmol/min/mg蛋白质（平均值±SEM；n个=5）*P（P）<0.05与车辆和**P（P）与车辆相比<0.01。(D类)用PINK1 siRNA或对照siRNA处理SH-SY5Y细胞或Park OE细胞72小时。最后16小时，用载体或CCCP处理细胞。然后测量CS活性。数据表示为nmol/min/mg蛋白质（平均值±SEM；n个= 5). *P（P）<0.05与对照siRNA+CCCP和**P（P）与对照siRNA+CCCP相比<0.01。
图3。
图3。
CCCP治疗后线粒体蛋白的泛素化。(A类)用载体[0.05%（v/v）乙醇]或10µ米CCCP 3 h，分离线粒体并进行western blot。用泛素抗体检测蛋白质印迹。通过探测复合物I的39 kDa亚基（箭头所示）来确定等负荷。四个单独实验的印迹代表。(B类)用CCCP处理Park OE细胞3h，分离线粒体并检测VDAC1或(C类)western blot法检测抑制蛋白（PHB1）。(D类)用CCCP处理Park OE细胞3h，用western blot检测细胞裂解液中的Drp1。(E类)从Park OE细胞分离的线粒体经载体或CCCP处理3 h后，检测MFN-1或(F类)通过western blot检测MFN-2。翻译后修饰的蛋白质用箭头表示。非特定波段用星号表示。印迹是至少四个独立实验的代表。
图4。
图4。
CCCP治疗后MFN-1和MFN-2的泛素化。(A类)包含空矢量或(B类)用10µ米使用针对MFN-1和MFN-2的抗体通过western blot评估0–3 h CCCP、制备细胞裂解物和MFN-1及MFN-2翻译后修饰。用抗线粒体蛋白SDHA的抗体对印迹物进行再验证，以评估每个裂解物中的线粒体含量。(C类)从含有载体或10µ米CCCP 2 h。内源性MFN-1从线粒体部分和泛素化物种中免疫沉淀，通过western blotting检测。然后用MFN-1抗体对印迹进行再验证。(D类)MFN-2从线粒体组分中免疫沉淀，并如上所述检测到泛素化。印迹是至少三个独立实验的代表。泛素化的物种用箭头表示。
图5。
图5。
MFN-1和MFN-2的泛素化需要Parkin和PINK1。(A类)对照组或Parkin KD细胞用载体或CCCP处理2 h，制备细胞裂解物和MFN-1或(B类)使用MFN-1和MFN-2抗体通过western blot评估MFN-2的泛素化。(C类)未转染SH-SY5Y细胞（UT），转染PINK1 siRNA#1或PINK1-siRNA#2或转染对照siRNA 72小时。然后用10µ米CCCP 2 h，制备细胞裂解物并用western blot分离。用针对MFN-1的抗体探测印迹，或(D类)MFN-2。用SDHA抗体对斑点进行线粒体含量的再验证。印迹是至少三个独立实验的代表。无所不在的物种用箭头表示。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Schapira A.H.，Tolosa E.帕金森病的分子和临床前驱症状：对治疗的影响。Nat.Rev.Neurol公司。2010;6:309–317.doi:10.1038/nrneul.2010.52.-内政部-公共医学
    1. Cuervo A.M.、Wong E.S.、Martinez-Vicente M.蛋白质降解、聚集和错误折叠。压敏电阻。迪索德。2010;25:S49–S54。doi:10.1002/mds.22718.-内政部-公共医学
    1. Schapira A.H.、Cooper J.M.、Dexter D.、Jenner P.、Clark J.B.、Marsden C.D.帕金森病线粒体复合物I缺陷。柳叶刀。1989;1:1269.doi:10.1016/S0140-6736（89）92366-0.-内政部-公共医学
    1. Schapira A.H.V.线粒体在帕金森病的病因和发病机制中的作用。柳叶刀神经病学。2008;7:97–109.doi:10.1016/S1474-4422（07）70327-7.-内政部-公共医学
    1. Betarbet R.、Sherer T.B.、MacKenzie G.、Garcia-Osuna M.、Panov A.V.、Greenamire J.T.慢性全身性农药暴露再现了帕金森病的特征。自然神经科学。2000;3:1301–1306.文件编号：10.1038/81834.-内政部-公共医学

出版物类型