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案例报告
.2010年12月15日;19(24):4837-47.
doi:10.1093/hmg/ddq414。 Epub 2010年9月21日。

编码FAD依赖性氧化还原酶复合物I特异性分子伴侣的FOXRED1在婴儿型线粒体脑病中发生突变

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案例报告

编码FAD依赖性氧化还原酶复合物I特异性分子伴侣的FOXRED1在婴儿型线粒体脑病中发生突变

伊丽莎·法索尼等。 人类分子遗传学. .

勘误表in

摘要

复合体I是呼吸链中第一个也是最大的酶,位于线粒体内膜。复合物I缺乏症是儿童期最常见的线粒体疾病,但大多数病例的分子基础尚不清楚。我们描述了一名由分子伴侣FOXRED1突变引起的复合物I缺乏症患者。对一个伊朗-犹太血亲家系进行了纯合子作图和生物信息学相结合的方法,在一名患有婴儿型脑肌病的儿童中鉴定出FOXRED1纯合子突变。人成纤维细胞中FOXRED1的沉默导致复合物I稳态水平和活性降低,而慢病毒介导的FOXRED1转基因表达挽救了患者成纤维细胞的复合物I缺陷。这种FAD依赖性氧化还原酶以前从未与人类疾病相关,现在被证明是一种复杂的I特异性分子伴侣。c.1054C>T的发现;FOXRED1基因中p.R352W突变为解决人类线粒体疾病遗传基础的复杂谜团做出了进一步贡献。

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图1。
图1。
复合物I全酶的BN-PAGE。BN-PAGE显示,与两个健康对照组(C1和C2)相比,患者(P)成纤维细胞中复合物I全酶稳态水平降低,并用NDUFB6抗体进行了检测。探测UQCR2(anti-complex III)和SDHA(anti-complex II)显示负载相等。
图2。
图2。
FOXRED1系列外显子9电泳图谱。显示测序结果的电泳图FOXRED1系列基因:患者的c.1054C>T突变为纯合子(上图),而对照序列为野生型纯合子。
图3。
图3。
FOXRED1系列突变RFLP分析。RFLP分析表明该突变与疾病分离:除了先证者外,该家族成员中没有一人是c.1054C>T突变的纯合子。父母是杂合子,未受影响的兄弟姐妹,无论是杂合的还是纯合的野生型序列。
图4。
图4。
FOXRED1系列蛋白质进化保护。这个FOXRED1系列蛋白质在不同物种的结构中有一个非常保守的模块。在该模块的一部分中,我们发现R352残基在物种间高度保守,这表明氨基酸变化R352W可能会产生重大的功能影响。
图5。
图5。
(A类)线粒体复合物I/IV试纸分析。油尺试验显示,患者成纤维细胞(Fbs)中残留的复合物I活性为~70%,与合成野生型互补后恢复到~90%狐狸红1cDNA。用空载体转染患者Fbs后,也可以看到轻微的恢复。FOXRED1系列-与打乱的成纤维细胞相比,沉默的成纤维纤维细胞的复合物I活性降低了约40%。关键:Fbs、成纤维细胞;RS,参考样品;FR1、,FOXRED1系列. (B类)蛋白质印迹分析。Western blot分析显示FOXRED1系列患者成纤维细胞中的NDUFA9蛋白含量FOXRED1系列野生型cDNA与用空载体转导的患者成纤维细胞进行比较。FOXRED1系列-沉默的成纤维细胞显示FOXRED1系列和NDUFA9蛋白含量与对照组和打乱的成纤维细胞进行比较。MTCO2(anti-complex IV)探测显示负载相等。使用Alpha Ease FC软件(Alpha Innotech/Cell Biosciences,Santa Clara,CA,USA)进行密度测量,并确认上述观察结果。
图6。
图6。
FOXRED1系列线粒体定位。图取自LIFEdb数据库,克隆ID:DKFZp586B1920。(A类)N-末端标记的低密度非特异性细胞质和细胞核染色FOXRED1系列蛋白质。(B类)C-末端标记的高强度荧光染色FOXRED1系列蛋白,具有典型的线粒体靶向蛋白的特征性点状信号。这些图像表明FOXRED1系列蛋白质干扰线粒体靶向序列的识别。棒,10µm。
图7。
图7。
线粒体下分离。~53 kDaFOXRED1系列蛋白质(箭头所示)显示出清晰的线粒体定位;更具体地说,它包含在可溶部分中并与IM相关。IMS和M中检测到的稍大条带可能代表一种包含线粒体靶向序列的未成熟多肽,然后将其裂解以释放成熟蛋白。然后,较小的成熟蛋白质与IM结合以实现其完全功能状态。使用抗线粒体蛋白的抗体测试组分的纯度:OM(和IM)的抗VDAC、抗细胞色素c(c)IMS(与IM相关也可见)和IM的抗MTCO2。关键:MT,整个线粒体;OM,外膜;IMS,膜间空间;M、 矩阵;SOL,可溶部分;INT,蛋白质积分分数。
图8。
图8。
FOXRED1蛋白质建模。基于芽孢杆菌单体肌氨酸氧化酶结构的FOXRED1蛋白模型(PDB代码:2gb0)。(A类)剩余R352和FAD部分的模型如填充表示所示。插图是R352和FAD之间关系的特写。(B类)R352W突变体的模型。观察到的色氨酸突变[R352W在(B)中假设可见]可能会将突变氨基酸侧链置于FAD的接触距离内,并干扰结合。

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