Fluorescent labeling of newborn dentate granule cells in GAD67-GFP transgenic mice: a genetic tool for the study of adult neurogenesis

doi:10.1371/journal.pone.0012506

.2010年9月2日；5（9）：e12506。

doi:10.1371/journal.pone.0012506。

GAD67-GFP转基因小鼠新生齿状颗粒细胞的荧光标记：研究成年神经发生的遗传工具

赵胜利¹, 杨舟, 吉米·格罗斯, 裴苗, 李秋, 王东青（Dongqing Wang）, 钱晨, 冯国平

附属公司

PMID： 20824075
预防性维修识别码： PMC2932690型
内政部： 10.1371/journal.pone.0012506

GAD67-GFP转基因小鼠新生齿状颗粒细胞的荧光标记：一种研究成年神经发生的遗传工具

赵胜利等。公共科学图书馆一号. 2010.

.2010年9月2日；5（9）：e12506。

doi:10.1371/journal.pone.0012506。

作者

赵胜利¹, 杨舟, 吉米·格罗斯, 裴苗, 李秋, 王东青（Dongqing Wang）, 钱晨, 冯国平

附属

¹美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心神经生物学系。

PMID： 20824075
预防性维修识别码： PMC2932690型
内政部： 10.1371/journal.pone.0012506

摘要

成人海马体的神经发生是大脑结构可塑性的一种重要形式。在这里，我们报道了一系列BAC转基因小鼠（GAD67-GFP小鼠），它们在成年海马的新生齿状颗粒细胞中选择性和暂时表达GFP。在注射BrdU一周后，这些GFP（+）细胞与BrdU标记的细胞核显示出高度共定位，并表达新生神经元标记物双重皮质素和PSA-NCAM。与成熟的齿状颗粒细胞相比，这些新生神经元表现出不成熟的形态特征：树突串珠状，树突分支和棘较少。这些GFP（+）新生神经元也表现出不成熟的电生理特性：较高的输入电阻，更多的去极化静息膜电位，较小且不典型的动作电位。新生神经元的绿色荧光蛋白（GFP）明亮标记使我们可以看到树突的细节，树突到达分子层的外缘，轴突（苔藓纤维）末端投射到CA3区，在那里形成突触束。GFP表达覆盖了新生神经元的整个发育阶段，从细胞分裂的第一周开始，随着新生神经元成熟，即有丝分裂后约4周消失。因此，GAD67-GFP转基因小鼠为研究新生齿状颗粒细胞的发育和调控提供了有用的遗传工具。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。GAD67-GFP转基因标记齿状回颗粒下区。**
**a、，**GFP在3月龄小鼠海马齿状回颗粒下区的表达。GAD67-GFP转基因标记齿状颗粒细胞层和门边缘的细胞。表达GFP的齿状颗粒细胞的轴突连接苔藓纤维通路并投射到透明层，而树突则到达分子层的外缘。**b-g，**3月龄小鼠不同区域的GFP表达模式。Z叠加共聚焦图像显示GFP在嗅球中的表达(b条)，上丘(**c（c）**)，小脑(d日)，皮层(**e（电子）**)，纹状体(**（f）**)和丘脑(克). 比例尺，100µm。

**图2。在GAD67-GFP-BAC转基因小鼠中，GFP标记的神经元是GABA能神经元。**
用特异性GAD67抗体对3月龄小鼠的脑片进行染色。Z叠加共聚焦图像显示GFP荧光和GAD67染色在小脑浦肯野细胞（a-a〃）、嗅球肾小球周围神经元（b-b〃）和皮层中间神经元（c-c〃）中的共定位。在齿状回中，表达GFP的细胞没有表现出强烈的GAD67染色。然而，苔藓纤维路径显示出强烈的GAD67信号（d-d〃，箭头）。比例尺，100µm。

**图3。GFP+颗粒细胞是新生神经元。**
**a-f、，**注射BrdU后不同阶段齿状回中BrdU标记的细胞核（红色）和GFP表达细胞（绿色）。箭头显示BrdU标记细胞核和GFP表达细胞的共定位。克，所有GFP+细胞都表达Prox-1，一种齿状颗粒细胞标记物。**小时，**同时也是GFP阳性的BrdU阳性细胞的百分比。共标记百分比在第1天为1.3±0.3%，第3天为2.1±0.3%、第1周为62.5±3.2%、第2周为70.8±3.1%、第3周为58.7±1.3%、第4周为7.4±1.9%（n = 每个时间点4只小鼠，平均值±SEM）。比例尺，20µm。

**图4。GFP+颗粒细胞表达新生神经元标记物。**
**a-b〃**，共聚焦图像显示GFP⁺细胞不与胶质细胞和神经干细胞标记物GFAP共定位(**a-a〃**)或增殖细胞标记物Ki67(**b-b〃**).c-d〃，GFP公司⁺细胞与新生神经元标记物PSA-NCAM精确共定位(**c-c〃**)和DCX(**d-d〃**).e-e〃，许多GFP⁺神经元标记NeuN（闭合箭头）的细胞呈弱阳性，而其他细胞呈阴性（开放箭头）或强阳性（箭头）。**f、，**GFP共定位的量化⁺具有各种细胞标记物的细胞（平均值±SEM）。图像是单个光学部分。比例尺，20µm。

**图5。GFP+新生齿状颗粒细胞的发育变化。**
Z叠加共聚焦图像显示GFP+新生神经元在2周、1个月、3个月、9个月、15个月和23个月时的发育变化。比例尺为100µm。

**图6。GFP+新生神经元形态不成熟。**
**a-c、，**来自9个月龄Thy1-GFP小鼠的表达GFP的成熟齿状颗粒细胞显示出短的一级树突，多个树突分支(一)，CA3区的大咽前隆起(b条)和棘状树突(**c（c）**).d-f，来自9个月大GAD67-GFP小鼠的表达GFP的新生齿状颗粒细胞显示出较长的一级树突，较少的树突分支和大量的树突静脉曲张(d日). 高倍图像还显示了CA3区域的苔藓纤维巨大隆起(**e（电子）**)树枝状串珠和较少的刺(**（f）**).克，在3个月大的GAD67-GFP小鼠中表达GFP的新生神经元的形态学异质性。箭头表示新神经元，其胞体形状不规则，突起短，平行于齿状颗粒细胞层。箭头表示新生神经元，胞体小，树突短，终止于分子内层；大多数新生神经元有较长的初级树突和更多的向分子层外缘突出的分支。h、在一只23个月大的小鼠中表达GFP的新生神经元。比例尺为50µm in克对于一,d日、和克；10µm英寸**e（电子）**对于b条和**e（电子）**；5µm英寸**（f）**对于**c（c）**和**（f）**；和50µm英寸小时.

**图7。GFP+新生神经元表现出未成熟神经元的电生理特性。**
一,b条GFP中电流注入诱导的小的非典型动作电位⁺新生神经元(一)和非GFP中的典型动作电位序列⁺成熟颗粒细胞(b条).c（c）、GFP⁺电池显示出较大的膜电阻（3.3±0.45 GΩ，n = 13）而非GFP成熟颗粒神经元膜电阻较低（0.37±0.08 GΩ，n = 10).d日,**e（电子）**在非GFP神经元中，刺激穿通通路诱发EPSCs的大反应(**e（电子）**)，但EPSC非常小，或GFP中没有EPSC⁺神经元(d日). 带有和不带NBQX的记录用蓝色和红色曲线表示。

**图8。GFP+新生神经元在不同的发育阶段具有不同的功能。**
一,b条、GFP代表性图片⁺早期单支神经元(一)晚期分支复杂（GFPc）(b条). 照片是由连接在显微镜上的CCD摄像机从活切片上拍摄的。**c（c）**,d日，代表性痕迹(**c（c）**)和统计结果(d日)微型EPSC。没有记录到来自GFP神经元的小型EPSC（红色 = 5） GFPc神经元（蓝色，n = 5）与非GFP成熟颗粒细胞（黑色，n = 6).e（电子）,**（f）**，典型示例(**e（电子）**)和统计分析(**（f）**)诱发的EPSCs。而在非GFP成熟颗粒细胞（黑色，n = 6），在GFPc神经元中诱发了非常小的EPSC（蓝色，n = 5） GFP神经元（红色，n = 6).

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1. Altman J，Das GD.大鼠出生后海马神经发生的放射自显影和组织学证据。《计算机神经学杂志》。1965;124:319–335。-公共医学
1. Eriksson PS、Perfilieva E、Bjork-Eriksson T、Alborn AM、Nordborg C等。成人海马的神经发生。《国家医学》，1998年；4:1313–1317。-公共医学
1. Gould E、Reeves AJ、Fallah M、Tanapat P、Gross CG等。东半球成年灵长类的海马神经发生。美国国家科学院院刊1999a；96:5263–5267.-项目管理咨询公司-公共医学
1. 总重心。成人大脑中的神经发生：教条的消亡。Nat Rev神经科学。2000;1:67–73.-公共医学
1. van Praag H、Schinder AF、Christie BR、Toni N、Palmer TD等。成年海马的功能性神经发生。自然。2002;415:1030–1034.-项目管理咨询公司-公共医学

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[3] Eriksson PS、Perfilieva E、Bjork-Eriksson T、Alborn AM、Nordborg C等。成人海马的神经发生。《国家医学》，1998年；4:1313–1317。-公共医学

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[5] Gould E、Reeves AJ、Fallah M、Tanapat P、Gross CG等。东半球成年灵长类的海马神经发生。美国国家科学院院刊1999a；96:5263–5267.-项目管理咨询公司-公共医学

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[7] 总重心。成人大脑中的神经发生：教条的消亡。Nat Rev神经科学。2000;1:67–73.-公共医学

[8] 总重心。成人大脑中的神经发生：教条的消亡。Nat Rev神经科学。2000;1:67–73.-公共医学

[9] van Praag H、Schinder AF、Christie BR、Toni N、Palmer TD等。成年海马的功能性神经发生。自然。2002;415:1030–1034.-项目管理咨询公司-公共医学

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