Epigenetic basis for aberrant upregulation of autoantigen genes in humans with ANCA vasculitis

doi:10.1172/JCI40034

.2010年9月；120(9):3209-19.

doi:10.1172/JCI40034。 Epub 2010年8月16日。

ANCA血管炎患者自身抗原基因异常上调的表观遗传学基础

多米尼克·J·西亚瓦塔¹, 杨家进, 格洛丽亚·普雷斯顿, 安舒尔·巴德瓦尔, 洪晓, 彼得·休因斯, 卡拉·M·内斯特, William F Pendergraph第三, 特里·R·马格努森, J查尔斯·詹妮特, 罗纳德·福尔克

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内政部： 10.1172/JCI40034

ANCA血管炎患者自身抗原基因异常上调的表观遗传学基础

多米尼克·J·西亚瓦塔等。临床研究杂志. 2010年9月.

.2010年9月；120(9):3209-19.

doi:10.1172/JCI40034。 Epub 2010年8月16日。

作者

多米尼克·J·西亚瓦塔¹, 杨家进, 格洛丽亚·普雷斯顿, 安舒尔·巴德瓦尔, 洪晓, 彼得·休因斯, 卡拉·M·内斯特, William F Pendergraph第三, 特里·马格努森, J查尔斯·詹妮特, 罗纳德·福尔克

附属

¹北卡罗来纳大学肾脏中心，UNC-Chapel Hill，Chapel Hill，North Carolina 27599-7155，USA。

采购管理信息： 20714105
PMCID公司：项目经理2929711
内政部： 10.1172/JCI40034

摘要

抗中性粒细胞胞质自身抗体（ANCA）会导致血管损伤，从而导致小血管性血管炎。ANCA患者异常表达中性粒细胞颗粒编码基因，包括2个编码自身抗原的基因：蛋白酶3（PR3）和髓过氧化物酶（MPO）。为了揭示ANCA血管炎患者PR3和MPO被破坏的潜在转录调控机制，我们检测了ANCA患者和健康对照个体中性粒细胞中PR3和MPO基因座与基因沉默相关的表观遗传学修饰。我们发现，与健康对照组相比，ANCA患者的PR3和MPO基因座中与基因沉默相关的染色质修饰H3K27me3水平下降。有趣的是，在患者和对照组中，PR3中的CpG岛上的DNA未甲基化，而在健康对照组中的MPO中，DNA甲基化。与H3K27me3水平下降一致，H3K17me3的去甲基化酶JMJD3优先在ANCA患者中表达，而非健康对照组。此外，我们描述了将玉米同系物2（EZH2）的H3K27甲基转移酶增强子招募到RUNX3介导的PR3和MPO位点的机制。与健康对照组相比，患者的RUNX3信息减少，也可能受表观遗传控制。ANCA患者RUNX3启动子处的DNA甲基化增加。这些数据表明，与基因沉默相关的表观遗传修饰受到ANCA自身抗原编码基因的干扰，可能导致ANCA患者PR3和MPO的不当表达。

PubMed免责声明

数字

**图1。*公关3*ANCA患者的基因转录活跃。**
(A类)的示意图*公关3*基因和加工*公关3*mRNA。箭头标记正向和反向引物（分别为FP和RP）的位置，用于用抗RNA聚合酶II抗体进行RNA免疫沉淀的RT-PCR分析。(B类)溴化乙锭染色琼脂糖凝胶显示RT-PCR产物对*公关3*6例ANCA患者中有4例存在mRNA。通道1，100-bp DNA阶梯；车道2，空白；3-8号通道，ANCA患者；9号车道，水上控制。

**图2。*公关3*和*多功能操作*ANCA血管炎患者中性粒细胞H3K27me3基因缺失。**
(A类–C类)健康对照组中性粒细胞染色质H3K27me3富集的定量ChIP分析（白色圆圈；n个=23）和ANCA血管炎患者（黑钻石；n个=15）显示为*公关3*(A类),*多功能操作*(B类)、和*MYO-D公司*(C类). H3K27me3免疫沉淀染色质的水平报告为输入DNA的百分比。5例ANCA患者中有4例临床缓解（虚线椭圆）；其余10人中有9人患有活动性疾病（补充表1和补充图3）。(D类)对数转换H3K27me3水平的Pearson相关分析*公关3*启动子与对数转换*公关3*ANCA患者（黑钻石，活跃；灰钻石，缓解）和健康对照组（白圈）的表达水平表现出适度的负相关(第页= –0.494;*P（P）=*0.0019). (E类)对数转换H3K27me3水平的Pearson相关分析*多功能操作*启动子与对数变换*多功能操作*ANCA患者和健康对照组的表达水平（符号如D类)呈负相关趋势，但无统计学意义(第页= –0.189;*P（P）=*0.264). 只有4名ANCA缓解患者出现，因为*公关3*和*多功能操作*1号ANCA患者未获得（补充表1）。

**图3。自身抗原和潜在调节因子的表达。**
(A类–D类)健康对照组总白细胞的相对mRNA水平（白色圆圈；n个=49）和ANCA血管炎患者（黑钻石；n个=97）用SYBR绿定量RT-PCR测定(A类和B类)或塔克曼(C类和D类). 患者与对照组的平均折叠变化（水平条）分别为1.77±1.76和1.00±0.38JMJD3公司(A类)，0.67±0.54对1.00±0.63运行NX3(B类)，19.77±60.08对1.00±1.58公关3(C类)和9.27±24.85对1.00±0.78多功能操作(D类). 异常值及其值（在括号中）显示为A类. (E类和F类)健康对照组Affymetrix微阵列数据的Spearman排名分析（白色圆圈；n个=16）和ANCA患者（黑钻石；n个=25）之间呈负相关*运行NX3*mRNA和*公关3*信使核糖核酸(*P（P）<*0.001;E类)以及介于*运行NX3*mRNA和*多功能操作*信使核糖核酸(*P（P）<*0.001;F类).

**图4。之间的反向相关性*运行NX3*表达和*公关3*或*多功能操作*表达是基因表达协同变化的结果。**
(A类–C类)相对信使核糖核酸水平*公关3*,*多功能操作*、和*运行NX3*来自未分化（白色条）或PMA-分化（灰色条）人类急性早幼粒细胞白血病细胞系HL60(A类)，急性单核细胞白血病细胞系THP-1(B类)和组织细胞淋巴瘤（单核细胞）细胞系U937(C类)用SYBR绿定量实时RT-PCR测定(*运行NX3*)或塔克曼(*公关3*和*多功能操作*). 数据代表了4-12个单独实验的中位数，精确值显示在下图中**P（P）<*0.05, ***P（P）=*0.001与未经治疗的配对t吨测试。(D类)通过流式细胞术测定未分化（黑色直方图）或PMA-分化（灰色直方图”）U937细胞的PR3蛋白水平。(E类)用Western blot检测24小时和48小时未分化或用PMA分化的U937细胞中RUNX3蛋白水平（箭头）。(F类和**G公司**)H3K27me3水平(F类)和RUNX3入住率(**G公司**)在*公关3*通过未分化（白条）和PMA-分化（黑条）U937细胞的定量ChIP分析测定。数据（平均值±SD）表示2个实验的DNA输入百分比，精确值显示在下图中。

**图5。RUNX3在U937髓系细胞沉默中的过度表达*公关3*表达式。**
(A类)相对*运行NX3*和*公关3*用SYBR绿实时定量RT-PCR法测定未分化U937细胞和未分化U93／P44细胞的mRNA水平(*运行NX3*)和塔克曼(*公关3*). (B类和C类)Western blot分析检测RUNX3(B类)和PR3(C类)如图所示，未分化U937和U937/P44细胞以及PMA分化的U937细胞中的蛋白质。车道进入B类在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。(D类)H3K27me3水平*公关3*通过未分化U937和U937/P44细胞的定量ChIP分析测定。数据显示了3个单独实验的DNA输入百分比，精确值显示在条形图上。

**图6。RUNX3绑定*公关3*和*多功能操作*骨髓细胞系和缓解期ANCA患者的基因。**
(A类)共识RUNX3结合位点*公关3*内含子4和*多功能操作*内含子7和3′UTR。(B类)RUNX3与*公关3*内含子4和*多功能操作*在指定的免疫沉淀条件下，未分化或PMA分化的U937细胞中的内含子7。正常兔血清用于模拟免疫沉淀。Lanes在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。(C类–E类)RUNX3绑定到的ChIP分析*多功能操作*内含子7和3′UTR(C类和D类)或至*多功能操作*内含子7和*公关3*内含子4(E类)活动性ANCA血管炎患者中性粒细胞中(C类)ANCA血管炎缓解患者(D类和E类). 通过Taqman定量RT-PCR测定相对mRNA水平*多功能操作*和*公关3*从ANCA血管炎患者的总白细胞中提取，计算为相对于健康对照组的倍数变化，精确值显示在条形图上。车道进入E类在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。

**图7。RUNX3直接与PRC2亚单位EZH2和EED相互作用。**
未分化和PMA分化U937细胞免疫沉淀蛋白的Western blot分析(A类和B类)和THP-1细胞(C类和D类). 用抗RUNX3免疫沉淀细胞提取物(A类和C类)或抗EZH2(B类和D类)用抗EZH2抗体进行Ab和Western blot(A类和C类)，反RUNX3(B类和D类)和抗EED(A类–D类)绝对值。正常IgG用于模拟免疫沉淀。车道进入B类在同一凝胶上运行，但不连续（白线）。

**图8。*Mpo公司*外周血中性粒细胞的信息水平对抗MPO IgG不敏感。**
鼠标*百万像素*通过实时定量PCR测定外周血白细胞的mRNA水平，并根据标准曲线绘制ΔCt值*Mpo公司*-阳性细胞被连续稀释*Mpo公司*-阴性细胞（参见方法和补充图5）。显示为*Mpo公司*未注射抗MPO IgG的C57BL/6和129只小鼠的信息水平，以及注射抗MPO-IgG 6天后129只鼠的信息水平。数据代表2个生物重复的平均值*Mpo公司*在分离RNA之前，纯化并汇总每类白细胞的水平。

**图9。的模型*公关3*和*多功能操作*正常中性粒细胞的基因沉默和ANCA血管炎患者的基因破坏，突出了H3K27me3修饰和调节组蛋白标记的酶的作用。**
(A类)正常成熟循环中性粒细胞中粒细胞基因沉默。我们假设维持转录沉默状态是一个动态过程。炎症细胞因子可诱导JMJD3（26）。我们目前对RUNX3和PRC2亚基之间相互作用的证明表明，RUNX3可以募集EZH2并重建H3K27me3。这种表观遗传修饰将保持转录沉默状态。(B类)在ANCA血管炎患者的中性粒细胞中，H3K27me3在*公关3*和*多功能操作*因为一个未知的过程，可能是在中性粒细胞发育过程中。另一种但并非相互排斥的可能性是，ANCA患者JMJD3的增加可以逆转静默状态*公关3*和*多功能操作*通过清除PcG介导沉默所需的组蛋白标记。低水平的RUNX3无法招募重建H3K27me3和维持转录沉默所必需的EZH2。此外，DNA甲基化在*多功能操作*也可能有助于保持转录沉默状态（未显示）。一个有趣的可能性是*公关3*和*多功能操作*在健康人中性粒细胞中处于转录平衡状态，标记为H3K27me3和H3K4me3（59）。在ANCA血管炎患者的中性粒细胞中，H3K27me3的缺失允许转录*公关3*和*多功能操作*.

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中的注释

血管炎综合征：沉默是金黄色的，因为表观遗传机制被认为是ANCA血管炎中自身抗原表达的原因。
Leah E.（Leah E.）。 Leah E.（Leah E.）。 Nat Rev风湿病。2010年11月；6(11):614. doi:10.1038/nrrheum.2010.168。 Nat Rev风湿病。2010 采购管理信息：21064238 没有可用的摘要。

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