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.2010年11月;9(11):2438-59.
doi:10.1074/mcp。M10.001859。 Epub 2010年7月20日。

人呼吸道合胞病毒感染A549细胞的定量蛋白质组分析

附属公司

人呼吸道合胞病毒感染A549细胞的定量蛋白质组分析

戴安·蒙迪等。 分子细胞蛋白质组学. 2010年11月.

摘要

人呼吸道合胞病毒(HRSV)是小儿下呼吸道疾病的主要病因,目前尚无疫苗或有效的化疗策略。虽然RNA合成和病毒组装发生在细胞质中,但众所周知,HRSV在复制改变全局基因表达时会在宿主细胞中诱导核反应。定量蛋白质组学用于无偏见地概述感染HRSV的转化人肺泡基底上皮细胞的蛋白质变化。其基础是在细胞培养中使用氨基酸稳定同位素标记结合LC-MS/MS,它可以直接同时鉴定和量化细胞和病毒蛋白。为了降低样品复杂性并增加潜在蛋白质定位的数据回报,将细胞分为细胞核和细胞质提取物。这导致了1140个细胞蛋白和6个病毒蛋白的鉴定。使用灵巧路径分析对蛋白质组学数据进行分析,以确定定义的典型路径和功能分组。选择的数据通过Western blot、直接和间接免疫荧光共聚焦显微镜和功能分析进行验证。该研究验证并扩展了已知的HRSV-host细胞相互作用,包括与抗病毒反应和核仁和ND10(早幼粒细胞白血病小体)等亚核结构改变相关的相互作用。此外,在线粒体蛋白和功能、细胞周期调节分子、核孔复合体蛋白和核质转运蛋白中观察到新的变化。这些数据揭示了细胞是如何被潜在地改变以创造更有利于感染的条件的。此外,该研究强调了在细胞培养中用氨基酸进行稳定同位素标记,并结合LC-MS/MS分析病毒-宿主相互作用的应用和优势。

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图1。
图1。
HRSV感染细胞SILAC定量蛋白质组学模拟感染细胞。 A类,本分析中使用的方法的图示。稳定同位素(中、重)标记的氨基酸被纳入新合成的细胞蛋白中。在模拟感染(培养基)的同时用HRSV(重型)感染A549细胞,并在感染后24小时进行亚细胞分离以丰富细胞质和核蛋白。在样品制备和LC-MS/MS分析之前,验证感染效率和组分纯度。B类,感染后24小时A549细胞中HRSV感染效率的间接免疫荧光共聚焦显微镜验证。在模拟感染细胞中用HRSV抗体组合染色作为对照。给出了不同的放大倍数。比例尺,20微米。C类,Western blot证实从模拟感染的细胞质和核部分富集的代表性蛋白质(M(M))和HRSV感染()单元格。用微管蛋白(~55kDa)和层粘连蛋白B1(~58kDa)抗体检测膜固定蛋白。管蛋白和层粘连蛋白B1分别主要定位于细胞质和核组分。D类、HRSV感染的Western blot确认(模拟感染细胞中缺乏)。通过HRP结合物检测到一种抗HRSV特异性多克隆一级抗体。分子质量标记(kDa)的位置在左边,蛋白质的暂定分配在正确的。RSV公司呼吸道合胞病毒。
图2。
图2。
HRSV感染A549细胞中细胞蛋白根据其分配分数和生物功能进行分类。对于定向,被分类为参与蛋白质合成的蛋白质正确的12点钟位置跟着顺时针方向的通过蛋白质合成、RNA转录后修饰、细胞生长和增殖、蛋白质降解(仅细胞质部分)、基因表达和RNA运输。不同指定功能的形式描述见补充表8.
图3。
图3。
核组分中主要参与细胞生长和转录调控的蛋白质的网络通路分析。蛋白质阴影绿色表明与模拟感染细胞相比,HRSV感染细胞的核部分丰度减少2倍或更多,并且颜色强度对应于丰度。蛋白质白色是通过灵巧途径知识库确定的。这个形状表示蛋白质的分子类别。A类实线表示直接分子相互作用,以及虚线表示间接分子相互作用。有关线条和关系的完整解释,请参见补充图3.
图4。
图4。
对主要参与分子运输(包括蛋白质和RNA运输)的核组分中确定的蛋白质进行网络通路分析。蛋白质阴影绿色表明与模拟感染的细胞相比,HRSV感染的细胞的核部分的丰度降低了2倍或更大,并且颜色强度对应于丰度。蛋白质白色是通过创新途径知识库确定的。这个形状表示蛋白质的分子类别。A类实线表示直接分子相互作用,以及虚线表示间接的分子相互作用。有关线条和关系的完整解释,请参见补充图3.
图5。
图5。
对细胞质组分中涉及细胞组装和组织、细胞妥协和蛋白质折叠的蛋白质进行合并网络通路分析。蛋白质阴影绿色表明丰度减少2倍或更多,蛋白质被遮住红色对应HRSV感染细胞的细胞质分数增加2倍或更多。这个颜色强度表示丰度。蛋白质白色是通过灵巧途径知识库确定的。这个形状表示蛋白质的分子类别。A类实线表示直接交互虚线表示间接交互。这个黄色线条表示通过NF-κB和STAT1信号传导途径之间的联系。有关线条和关系的完整解释,请参见补充图3.
图6。
图6。
HRSV感染细胞线粒体蛋白质丰度和线粒体完整性的改变。图示显示了线粒体内外膜,在定量蛋白质组分析中确定了具有代表性的蛋白质,并显示了其适当的线粒体定位。在线粒体外膜中,Tom20和Tom22与其他Tom(其中一些已在本分析中确定)相互作用,形成一个孔,通过该孔运输前线粒体蛋白质。跨膜孔(如VDAC)可能参与渗透性过渡孔复合体的形成,该复合体负责线粒体产物(如细胞色素)的释放c(c)触发细胞凋亡。内膜包含参与电子传递链的蛋白质复合物。呼吸复合物1、3和4是质子泵。那些参与细胞增殖和完整性的蛋白质,如PHB亚基PHB1和PHB2也存在于线粒体中。
图7。
图7。
A类,间接免疫荧光共聚焦显微镜分析NDUFB10在感染后24小时模拟和HRSV感染的A549细胞中的亚细胞定位。NDUFB10蛋白质染色红色,HRSV蛋白如所示绿色,细胞核被染色蓝色使用DAPI。还显示了合并图像。B类C类,线粒体外膜蛋白实例的间接免疫荧光共聚焦显微镜分析,其丰度在感染后24小时模拟和HRSV感染的A549细胞中Tom20和Tom22的亚细胞定位的定量蛋白质组学分析中显示变化。20岁以下(B类)和Tom22(C类)蛋白质被染色红色,HRSV蛋白是绿色,细胞核染色蓝色使用DAPI。还显示了合并图像。比例尺,20微米。RSV公司呼吸道合胞病毒。
图8。
图8。
间接免疫荧光共聚焦显微镜分析线粒体跨膜和内膜蛋白实例,其丰度在感染后24小时模拟和HRSV感染的A549细胞中VDAC1和PHB亚细胞定位的定量蛋白质组分析中显示变化。VDAC1蛋白(A类)和PHB蛋白(B类)被污染了红色,HRSV蛋白是绿色,细胞核染色蓝色使用DAPI。还显示了合并图像。比例尺,20微米。RSV公司呼吸道合胞病毒。
图9。
图9。
感染后24小时模拟和HRSV感染A549细胞线粒体过渡孔活性的活细胞共焦显微镜分析。细胞核染色蓝色与赫赫斯特。所有线粒体都被染色红色使用MitoTracker(A类),健康细胞也被染色绿色钙黄绿素AM(B类),它集中在线粒体中。合并的图像也出现了(C类). 阳性对照细胞用离子霉素处理,以允许过量的钙进入细胞,从而触发线粒体孔激活,从而导致钙黄绿素AM的释放,从而导致绿色荧光的丧失。HRSV感染细胞中的大部分线粒体被染色红色而且只有微弱的绿色,表明HRSV感染影响线粒体过渡孔活性。比例尺,20微米。注意,间接免疫荧光共聚焦显微镜用于证明细胞感染了HRSV,这些数据在补充图2.
图10。
图10。
HRSV感染细胞中参与核质转运的蛋白质的潜在破坏。 A类,核孔复合体的图示,显示了在HRSV感染的定量蛋白质组分析中其丰度发生改变的核孔蛋白的示例模拟感染细胞和核质转运蛋白。许多核蛋白相互作用,并与其他核膜蛋白相互作用;例如,nup53与nup98和层粘连蛋白B相互作用。B类间接免疫荧光共聚焦显微镜分析感染24小时后模拟和HRSV感染的A549细胞中核蛋白层粘连B亚细胞定位。拉明B蛋白染色红色,HRSV蛋白如所示绿色细胞核被染色蓝色使用DAPI。还显示了合并图像。比例尺,20微米。RSV公司呼吸道合胞病毒。
图11。
图11。
A类HRSV感染者细胞周期调节蛋白和亚核结构成分的Western blot分析(RSV公司)模拟感染细胞(M(M))存在于细胞质和核组分中。为了验证组分富集和负荷控制,分别使用微管蛋白和层粘连蛋白B作为细胞质和细胞核的标记。
图12。
图12。
HRSV感染者ND10s的间接免疫荧光共聚焦显微镜分析感染后24h模拟感染细胞(A类)感染后36小时(B类)如图所示。PML蛋白(ND10s的主要成分)被染色红色,HRSV蛋白是绿色细胞核中的DNA被染色蓝色使用DAPI。还提供了一个合并图像。C类,直接免疫荧光共聚焦显微镜分析感染后24小时模拟和HRSV感染的A549细胞中重组FLAG标记的PML亚型PML-I和PML-II的亚细胞定位。PML-I和PML-II蛋白是红色,HRSV蛋白是绿色细胞核被染色蓝色使用DAPI。比例尺,20微米。RSV公司呼吸道合胞病毒。
图13。
图13。
转染后48小时A549细胞ECFP、ECFP-M2-1和ECFP-P过度表达分析的直接免疫荧光共聚焦显微镜分析。ECFP为假彩色绿色细胞核中的DNA被染色红色加碘化丙啶(圆周率).

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