跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

网站是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2010年9月15日；430(3):551-8.
doi:10.1042/BJ20100757。

人类ERAL1是线粒体RNA伴侣，参与28S小线粒体核糖体亚基的组装

斯文·丹纳莱因 1, 阿加塔·罗赞斯卡, 马特乌斯·威德罗, Zofia M A Chrzanowska-灯笼, Robert N Lightowlers公司
附属公司

人类ERAL1是线粒体RNA伴侣，参与28S小线粒体核糖体亚基的组装

斯文·丹纳莱因等。 生物化学杂志. .

摘要

细菌Ras-like蛋白Era以前曾被报道在30S核糖体亚单位内结合16S rRNA，并在核糖体组装中发挥关键作用。这种必需的GTPase ERAL1（Era G-蛋白样1）的同源物存在于高等真核生物中，尽管其确切的分子功能和细胞定位尚不清楚，但其缺失与凋亡有关。在本研究中，我们表明人类ERAL1是一种线粒体蛋白，对28S小核糖体亚基的形成非常重要。我们还表明，ERAL1在体内与小亚基的rRNA成分结合[12S mt（线粒体）-rRNA]。细菌时代与16S rRNA末端干环（螺旋45）下游紧邻的一个3'非结构非核苷酸相关。该位点包含一个AUCA序列，该序列在所有生命领域高度保守，紧邻细菌中保守的反Shine-Dalgarno序列上游。引人注目的是，12S mt-rRNA中没有这个完整的区域。我们将ERAL1-b结合位点映射到一个33核苷酸片段，该片段描绘了12S mt-rRNA的3’末端干环区域。该环含有两个腺嘌呤残基，据报道在有丝分裂核糖体成熟时被二甲基化。此外，与细菌直系同源物相比，ERAL1的缺失导致新生12S mt-rRNA的快速衰变，这与线粒体RNA伴侣的作用一致。最后，尽管ERAL1的缺失会导致细胞凋亡，但细胞死亡发生在线粒体蛋白质合成明显减少或线粒体mRNA稳定性降低之前。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。ERAL1与28S mt-SSU合作
(A类)左侧面板：用所示抗体对HEK-293T细胞亚组分为核（N）或细胞质（Cp）亚组分的蛋白质印迹分析，后者进一步分为线粒体（M）和细胞溶质（Cs）组分。加载每个分数的等效体积。右侧面板：用指示量的蛋白酶K预处理线粒体（30μg），并用Triton X-100溶解或直接用指示抗体进行Western blot分析。(B类)在分馏和Western blot分析之前，通过等速梯度离心分离HeLa细胞裂解物（0.7 mg），如实验部分所述，以指示有丝分裂核糖体亚单位的位置（DAP3表示28S mt-SSU；MRPL3表示39S mt-LSU）。印迹是三个独立重复的代表。(C类)用等速梯度离心法从表达MRPS27–FLAG的细胞线粒体中分离出洗脱的免疫沉淀物，部分被银染（上表）或用所示抗体进行免疫印迹（下表）。28S mt-SSU，灰色圆圈；39S mt-LSU，黑色六边形。凝胶是两个独立重复的代表。
图2
图2。ERAL1是组装28S小核糖体亚单位所必需的
(A类)HEK-293T细胞裂解物（5、10或15μg）经NT或三个独立ERAL1靶向siRNAs预处理3天，并用抗ERAL1或抗β-肌动蛋白抗体进行检测的Western blot。靶向Eral1的3′-UTR的UTR，siRNA；ORF1和ORF2，靶向开放阅读框区域的siRNA。在所有进一步的siRNA实验中，通过Western blotting证实ERAL1的缺失。(B类)在非靶向（NT）或ERAL1缺失（ORF1）siRNA作用3天后，表达MRPS26–FLAG的细胞免疫沉淀物的Western blot。28S mt-SSU的有丝分裂核糖体亚单位的位置用标记DAP3、MRPS18B和MRPS25表示，39S mt-LSU的用标记MRPL3和MRPL12表示。量化是在三个独立的实验中进行的。在每一种情况下，信号都被归一化为免疫沉淀物中MRPS26的水平。结果为平均值+S.D(C类)表达ICT1–FLAG的细胞免疫沉淀物的Western blot。面板的实验细节和数据分析(A类) (n个=3). (D类)对用si-NT处理的HEK-293T细胞或ERAL1缺失（si-ORF1）后4天分离的4μg RNA进行Northern blot。显示了来自四个独立实验的RNA。探针突出显示编码复合物I（MTND2）、复合物III（MTCYB；线粒体编码的细胞色素）成分的转录物b条)和复合物IV（MTCO3，COX3）以及16S（MT-RNR2）和12S（MT_RNR1）MT-rRNA。人类18S rRNA探针显示为负载和质量控制（18S）。量化显示了来自四个重复的14个独立转录本。结果为平均值+S.D***P（P）<0.001, **P（P）<0.01*P（P）<0.05.
图3
图3。ERAL1结合体内12S mt-rRNA预测的3′末端茎环
ERAL1结合的短RNA物种体内根据实验部分所述的CLIP分析确定。(A类)列出了12S mt-rDNA的50 nt 3′末端残基的序列，相当于线粒体基因组的nt 1551–1601[1]，以及mt-tRNA的前四个5′残基瓦尔，紧靠下游。每个克隆的整个插入显示为跨越参考序列相应部分的填充线，并指示具有相同序列的克隆数。最小ERAL1-绑定站点已装箱。粗体AA突出显示了nt 1582–1583处的二甲基化腺嘌呤残基。所有31个克隆的序列见补充表S1（http://www.BiochemJ.org/bj/430/bj4300551add.htm). *, 这两个克隆在第1582-1584天因A三联体的两个A残基而被删除。(B类)图中显示了线粒体12S（左侧）或细菌16S（螺旋45，右侧）[22]中高度保守的3′末端干环结构，以及末端非结构核苷酸。ERAL1的最小33 nt结合位点，以及所描述的阿基菲克斯·埃奥利希乌斯纪元[12]以实线突出显示。高度保守的AUCA以粗体显示；反SD区域CCUCC为斜体。两个二甲基化腺嘌呤如大纲[23,24]所示。
图4
图4。ERAL1的耗竭导致细胞凋亡，然后线粒体蛋白质合成明显减少
(A类)用NT对照或三个独立siRNA中的每一个靶向于埃拉L1打开阅读框（ORF1；ORF2）或对应的3′-UTR。对三个（HeLa）或六个（HEK-293T）独立重复进行计数***P（P）<0.001。(B类)用siRNA（NT或抗ERAL1）处理三天的HeLa细胞，对线粒体基因产物进行代谢放射标记30分钟。用SDS/PAGE分离等分试样（50μg），并用实验部分所述的磷光图像进行可视化。线粒体基因产物来自[20]。暴露、复水和考马斯蓝（CB）染色后，显示凝胶的一小部分，以确认负载相等。ATP8，线粒体编码的ATP合成酶8；Cytb，细胞色素b条; ND、NADH脱氢酶。(C类)从头开始siRNA处理3天后HEK-293T细胞裂解物中mt蛋白的合成（左图）和稳态水平（右图）（siORF1或NT对照）。代谢标记的量化表示为每个翻译产物的NT对照百分比，并来自三个独立的实验。COX1/ND4、COX2/ATP6和ND4L/ATP8被一起量化，因为它们不能自信地独立量化。Western blot分析显示有丝分裂核糖体蛋白与文中所述抗体；使用的标记为：对于复合物I，NDUFB8和NDUFA9；对于复合物IV，COX2；线粒体基质为伴侣蛋白HSP70，线粒体外膜为孔蛋白。结果为平均值+S.D。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

参考文献

    1. Anderson S.、Bankier A.T.、Barrell B.G.、De Bruijn M.H.L.、Coulson A.R.、Drouin J.、Eperon I.C.、Nierlich D.P.、Roe B.A.、Sanger F.等人。人类线粒体基因组的序列和组织。自然。1981;290:457–465.-公共医学
    1. Sharma M.R.、Koc E.C.、Datta P.P.、Booth T.M.、Spremulli L.L.、Agrawal R.K.哺乳动物线粒体核糖体的结构揭示了其组成蛋白质的扩展功能作用。单元格。2003;115:97–108.-公共医学
    1. O'Brien T.W.人类线粒体核糖体的性质。IUBMB寿命。2003;55:505–513.-公共医学
    1. Magalhaes P.J.，Andreu A.L.，Schon E.A.哺乳动物线粒体中存在5S rRNA的证据。分子生物学。单元格。1998;9:2375–2382.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Smirnov A.、Tarassov I.、Mager-Heckel A.M.、Letzelter M.、Martin R.P.、Krasheninikov I.A.、Entelis N.将5S rRNA导入人体线粒体需要两种不同的结构元素。RNA.2008；14:749–759。-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语