跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2010年9月；84(17):8888-902.
doi:10.1128/JVI.00687-10。 Epub 2010年6月23日。

腺相关病毒2型衣壳蛋白VP1的突变揭示了碱性氨基酸在贩运和细胞特异性转导中的新作用

贾罗德·约翰逊 1, 李成文, 妮娜·迪普里西奥, 马克·温伯格, 托马斯·麦考恩, R朱德·桑尔斯基
附属公司

腺相关病毒2型衣壳蛋白VP1的突变揭示了碱性氨基酸在运输和细胞特异性转导中的新作用

贾罗德·约翰逊等。 J维罗尔. 2010年9月.

摘要

腺相关病毒（AAV）衣壳蛋白VP1和VP2的N末端在感染的亚细胞步骤中起着重要作用，并且包含与磷脂酶a（2）（PLA（2））结构域和核定位信号（NLS）高度同源的基序。为了更清楚地了解病毒成分如何影响感染，我们在这些区域产生了突变，并检测了它们对亚细胞贩运、衣壳稳定性、转导和药物增强敏感性的影响。所有测试的突变体组装成衣壳；保留正确的VP1、VP2和VP3比率；与重组AAV2（rAAV2）相似的包装DNA；在热变性时表现出相似的稳定性曲线。共聚焦显微镜显示，这些突变体通过高尔基体附近的核周区域进行转运，其中一部分突变体显示出与NLS缺陷表型一致的更多扩散定位。当测试病毒转导时，出现了两类突变。I类（BR1（-）、BR2（-）和BR2+K）显示部分转导，而II类（仅VP3、（75）HD/AN、BR3（-）以及BR3+K）严重缺陷。令人惊讶的是，一个II类突变体（BR3+K）与rAAV2完全相同，并在核仁中积累，这是我们实验室最近描述的野生型感染的一个步骤。BR3+K突变体在VP1的第三个碱基区含有丙氨酸-赖氨酸替代，在转化细胞系（如HEK-293、HeLa和CV1-T细胞）中的感染性比rAAV2低10到100倍，但与此相反，在一些非转化细胞系中，它与rAAV1没有区别，以及体内组织（肝脏、大脑和肌肉）。药物佐剂或腺病毒复合感染的补充研究表明，NLS区域的额外正电荷限制了细胞核的动员，并以转化细胞特异性的方式限制了转导。值得注意的是，除了显示细胞类型特异性转导外，这是对衣壳突变体的首次描述，表明核进入不足以进行AAV介导的转导，并表明额外的步骤（即亚核动员或解开外壳）限制了AAV的成功感染。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
VP1/2 N端突变影响rAAV的转导。（A） AAV基因组包含编码复制相关Rep蛋白和组成衣壳的Cap蛋白的基因。特定Cap蛋白含有磷脂酶结构域（PLA2)（HD）和基本区域（BR）（+）是假定的核定位信号。（B） 本研究中使用的衣壳突变体按序列列出，氨基酸变化以红色字母显示。（C） 纯化病毒（5×10）的Western blot（WB）分析9vg）用检测VP1、VP2和VP3的抗体B1进行印迹。（D和E）荧光素酶检测HEK-293细胞（D）和HeLa细胞（E）的转导。细胞接种rAAV2或包装TR-CMV-Luc的突变体（10000 vg/细胞），24小时后定量荧光素酶活性。误差条代表三个独立样本的标准偏差。
图2。
图2。
衣壳突变体的亚细胞定位。体积成像软件用于处理z（z）-衣壳突变体（10000 vg/细胞）感染HeLa细胞16小时的叠加共聚焦图像显示衣壳（绿色）与高尔基体标记giantin（红色）和细胞核（蓝色）的关系。所有突变体，连同rAAV2，都显示出与高尔基体和BR1有一定程度的共定位−突变体是最强烈的。BR2−和BR3−与rAAV2和其他突变体的定位相比，衣壳突变体除了定位于高尔基体外，似乎在整个细胞中都有扩散定位。
图3。
图3。
VP1 N端子暴露。（A） 特异性检测完整衣壳（A20）、VP1 N末端（A1/αVP1）或分解亚基（B1）的抗体允许分析构象变化在体外对有限的热处理或感染期间的细胞内反应（即磷脂酶和NLS基序的暴露）。（B） 免疫印迹显示VP1 N末端的暴露。rAAV2病毒或空衣壳在指定温度下有限热处理10分钟后，将其暴露于有限热处理下，涂敷在硝化纤维素膜上，与所示抗体孵育，并在处理后形成化学发光。空衣壳更耐暴露VP1。（C） 衣壳突变体VP1暴露的免疫印迹比较（1×109vg/井）。如A20反应性损失和B1反应性增加所示，盖子在75°C之前拆卸。在将衣壳加热到60°C后，存在中间构象变化，其中检测到VP1表位，但衣壳保持完整。（D） 免疫荧光显微镜显示感染期间VP1暴露。帽状体（绿色）显示核周区VP1暴露（红色）。VP1暴露不足的空衣壳和缺乏VP1的仅VP3颗粒未显示出αVP1（氨基酸[aa]2至16）的显著信号。感染力最低的两个突变体，75HD/AN和BR3−，在感染期间没有失去暴露VP1的能力，这意味着感染期间后期的功能障碍是导致转导丢失的原因。
图4。
图4。
蛋白酶体抑制对衣壳突变体核仁积累和转导的影响。将MG132（2μM）与病毒粒子（10000 vg/细胞）同时注入HeLa细胞，16 h后，制备样品用于免疫荧光显微镜。发现rAAV2、BR2+K和BR3+K衣壳（绿色）在细胞核内积聚（白色箭头），仅VP3衣壳，75HD/安，BR1−，BR2−和BR3−衣壳主要局限于核外区域。（B） 感染后核仁的亚细胞分离。HeLa细胞被突变病毒（1000 vg/细胞）感染16 h，并进行亚细胞分离。通过Western blotting在核仁组分中检测到rAAV2和BR2+K和BR3+K突变体的衣壳蛋白。（C） 蛋白酶体抑制剂存在下转导的荧光素酶分析。在MG132（2μM）存在下感染HEK-293细胞（10000 vg/细胞）24小时，然后对转导效率进行评分。误差线表示三个独立样本的标准偏差。
图5：。
图5：。
与rAAV相比，BR3+K衣壳的稳定性。（A） 纯化的病毒制剂进行醋酸铀负染，并应用于放电铜栅上进行电子显微镜检查。比例尺代表50 nm。（B） 有限热处理（指定温度下10分钟）后抗体反应性的免疫印迹表明rAAV2和BR3+K衣壳具有相似的大分子稳定性。衣壳在75°C（A20）下不再完整，VP1 N末端在57°C后暴露，在65°C下可以显著检测到两种衣壳的分解亚基。（C） 热处理后，用DNA酶处理病毒，并提交qPCR以比较基因组保护。rAAV2和BR3+K突变体在热处理后具有相似的DNA酶敏感性模式。线图代表了三个实验之一的数据。
图6。
图6。
荧光就地杂交显示，BR3+K突变体的DNA在感染期间被传递到细胞核。在没有（左）或存在（右）MG132的情况下，用rAAV2或BR3+K突变株（10000 vg/细胞）感染HeLa细胞16小时。使用与TR-Luc基因组的反义链互补的RNA探针制备细胞用于FISH。对照样品（i和iv）中无染色表明探针缺乏非特异性结合。在蛋白酶体抑制期间，rAAV2（v）和BR3+K（vi）基因组（红色）都聚集在细胞核中，特别是核仁区域。
图7。
图7。
HU处理不会将BR3+K衣壳动员到核质。为了观察BR3+K突变衣壳是否能被HU动员到核质中，我们固定并染色感染的HeLa细胞，对衣壳（绿色）、核仁蛋白（红色）和细胞核（蓝色）进行间接免疫荧光。使用Volocity软件（i）将大约40个跨度为5μm的共聚焦切片堆叠并呈现为三维。通过首先对蓝色通道（DAPI，代表细胞核）和红色通道（核仁蛋白，代表核仁）进行数字选通，并增加缩放比例，生成了一部电影来详细探索衣壳定位。在电影的连续阶段拍摄了图像，以揭示核仁的内部（ii和iii）和核仁内部（iv）。rAAV2和BR3+K突变体在蛋白酶体抑制剂（白色箭头）存在下积聚在细胞核中。HU处理后，只有rAAV2定位于核质位点（白色箭头，rAAV2.空箭头，BR3+K突变）。
图8。
图8。
BR3+K突变体在转化细胞中的效率明显低于rAAV2，但在肝脏、大脑和肌肉组织中与rAAV1没有区别体内（A）转化细胞系，如HEK-293、HeLa或CV1-T细胞，接种rAAV2或BR3+K突变体（1000 vg/细胞）（TR-CBA-Luc转基因），24小时后检测转导效率。在这些细胞系中，rAAV2-转导效率至少是BR3+K突变的10倍。（B） 在与上述条件相同的条件下，对正常细胞系HepG2（人肝细胞）、C2C12（小鼠成肌细胞）和CV1（绿猴肾细胞）进行rAAV2或BR3+K突变体的转导效率检测（A）。rAAV2和BR3+K突变体在未转化细胞中的转导效率相似（在2倍以内）（*，P（P）A和B的值≤0.01）。请注意，HepG2细胞来源于腺癌，但不含病毒抗原，并显示出正常肝细胞的许多特征。（C） rAAV2或突变病毒（1010vg）通过尾静脉注射给雌性BALB/c小鼠，1周和2周后观察生物荧光荧光素酶活性。颜色比例尺表示光子/s/cm2，显示的数据是每个载体组中三到四只老鼠的代表性图像。（D） rAAV2或BR3+K包装GFP转基因（3.8×108脑内注射vg）至大鼠纹状体。注射后两周，将大脑固定，并用DAB作为底物和镍钴强化处理冠状切片以检测GFP。（E） 与D中描述神经元转导和相关过程（暗染色）的图像相似的冠状切片图像的高倍放大。（F） 肌肉注射rAAV2（右后肢）和BR3+K（左后肢）包装Luc转基因后2周获得的转导生物发光图像。
图9：。
图9：。
用于说明BR3+K突变体的转化细胞类型特异性缺陷的模型。（A） rAAV2的进入途径从细胞表面的糖蛋白受体结合到内吞作用，运输到核周室，逃逸到细胞质，进入细胞核，并动员到核质的未知区域。（B） BR3+K突变体的转运与rAAV2的转运无明显区别，除了在转化细胞中，其向核质的转运效率不如rAAV1（图7，见补充材料中的电影S1）。细胞转化修饰了几个可能影响BR3+K突变体贩运和转导的核过程（见讨论）。这些变化可能影响BR3+K突变体在核进入后但在基因表达前的处理（亚核定位或脱膜）。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Ahuja，D.、M.T.Saenz-Robles和J.M.Pipas。2005年。SV40大T抗原以多种细胞途径为靶点，诱导细胞转化。癌基因24:7729-7745。-公共医学
    1. Bantel-Schaal，U.、B.Hub和J.Kartenbeck。5型腺相关病毒的内吞作用导致病毒颗粒在高尔基体室积聚。J.维罗尔。76:2340-2349.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bartlett、J.S.、R.Wilcher和R.J.Samulski。2000.腺相关病毒和腺相关病毒载体的感染途径。J.维罗尔。第74:2777-2785页。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Berns，K.I.和C.Giraud。1996年，腺相关病毒生物学。货币。顶部。微生物。免疫学。218:1-23.-公共医学
    1. Bleker，S.、F.Sonntag和J.A.Kleinschmidt。2005.对腺相关病毒2型衣壳五重对称轴上的细孔的突变分析揭示了在基因组包装和磷脂酶A2活性激活中的双重作用。J.维罗尔。79:2528-2540.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语