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.2010年6月10日；6（6）：e1000983。
doi:10.1371/journal.pgen.1000983。

E1A-相关p400蛋白通过调节ROS稳态来调节细胞命运决定

莉斯·马特拉 1, 塞林·库里劳, 勒古贝, 上田武史, 福田里基罗, 马丁·切维拉尔德·布雷特, 伊万·卡尼特罗, 织物Escapfit, 迪迪埃剧团
附属公司

E1A-相关p400蛋白通过调节ROS稳态来调节细胞命运决定

莉斯·马特拉等。 公共科学图书馆-基因. .

勘误表in

  • 公共科学图书馆-遗传学。2010年8月；34(8). doi:10.1371/annotation/cc3111d5-d475-43ea-8d7f-f8b477b27164

摘要

p400 E1A相关蛋白，介导H2A。特定启动子的Z掺入在细胞命运决定中起着重要作用：它促进细胞周期进展并抑制诱导凋亡或衰老。在这里，我们表明p400表达是正确控制活性氧代谢所必需的。p400的耗尽确实会增加细胞内ROS水平，并导致DNA损伤的出现，这表明p400将氧化应激维持在DNA损伤发生的阈值以下。使用抗ATM的siRNA抑制DNA损伤反应可抑制p400对细胞周期进展、凋亡或衰老的影响，表明依赖ATM的DDR通路在p400控制细胞命运中的重要性。最后，我们发现p400的这些作用依赖于特定启动子的直接转录调节，也可能涉及氧化应激和DNA断裂之间的正反馈回路，因为我们发现持续的DNA断裂足以增加ROS水平。总之，我们的结果揭示了p400和活性氧代谢之间的意外联系，并使我们能够破译主要负责p400控制细胞增殖的分子机制。

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数字

图1
图1。DNA微阵列数据的基因奇异注释。
使用两个对照组和两个不同的p400靶向siRNA分别转染U2OS细胞。48小时后制备总RNA，并将其提交到Affymetrix DNA微阵列（GeneChip Human Gene 1.0 ST Array）上进行逆转录、cDNA质量控制和杂交。在对两个独立实验进行量化后，使用GeneSpring GX软件（安捷伦科技公司）进行归一化和统计分析。合格的基因是指在四个比较中至少三个以相同方式调控的基因（p400靶向siRNAs与控件），折叠变化至少等于1.25。使用GeneCoDis2在线软件进行基因注释发现。
图2
图2。p400缺失导致ROS积累和DNA损伤诱导。
（A） 使用所示的siRNA转染U2OS细胞。转染后48和72小时（如所示），收集细胞并用流式细胞仪测定ROS水平。显示了3个独立实验的平均值和标准偏差（SD）（对于转染对照siRNA的细胞，相对于1进行标准化后）。（B） 使用指示的siRNA转染U2OS细胞，并在转染后48 h收集细胞，用流式细胞仪测定ROS水平。显示了3个独立实验的平均值和SD（相对于1，对转染对照siRNA的细胞进行标准化后）。（C） 如图所示，从靶向一个p400等位基因（p400Mut/+）的杂合子胚胎或来自对照野生型胚胎（wt）的MEF，分别用10 mM的H2O（运行）2持续15分钟H2O（运行）2在指定的时间后，清洗并收集细胞。用流式细胞仪测定ROS水平。通过减去未处理细胞中的ROS水平来计算ROS水平的增加（平行测量）。显示了2至3个独立实验的平均值和SD（相对于未处理细胞的1进行标准化后）。使用指示的siRNA转染（D，E）U2OS细胞，转染后48小时，对细胞进行彗星测定。代表性单元格如（D）所示。来自三个独立实验的彗星阳性细胞比例（尾矩>5）的平均值和SD如（E）所示（对于转染p400-1 siRNA的细胞，相对于100计算）。
图3
图3。p400可防止ROS诱导的DNA损伤。
（A） 使用指示的siRNA转染U2OS细胞，并用NAC（10 mM）处理。48h后收集细胞，流式细胞仪检测ROS水平。显示了2个独立实验的平均值（相对于1，用对照siRNA转染和未处理的细胞进行标准化后）。（B） 使用指示的siRNA转染U2OS细胞，24小时后用NAC（10 mM）处理。转染后48h，对细胞进行彗星试验。显示了来自三个独立实验的彗星阳性细胞比例的平均值和SD（尾矩>5）（对于转染p400-1 siRNA且未经处理的细胞，计算相对100）。（C，D）与（A）中相同，只是细胞被固定，并接受DAPI染色和使用抗γH2AX抗体的免疫荧光分析。代表性字段显示在（C）中，使用ImageJ软件的量化显示在（D）中（显示了3个独立实验的平均值和SD（对于转染p400 siRNA且未经处理的细胞，在相对于100进行标准化后））。
图4
图4。p400缺失导致DNA损伤反应的诱导。
（A） 使用指示的siRNA转染U2OS细胞。转染后48 h，固定细胞，并进行DAPI染色和使用抗磷酸ATM抗体的免疫荧光分析。代表性字段显示在左侧，使用ImageJ软件量化显示在右侧（显示了3个独立实验的平均值和SD（相对于1标准化后，用对照siRNA转染的细胞））。（B） 与（A）中相同，不同的是，使用抗-ATM、抗-Phospho-ATM、抗-p53和抗-HDAC1/2（作为负荷控制）抗体制备并通过western blot分析总细胞提取物。请注意，星号表示磷蛋白-p53面板中的非特异性带。（C） 使用指示的siRNA单独或组合转染U2OS细胞。使用对照siRNA使转染中的siRNA总量保持恒定。48小时后，制备总细胞提取物，并使用抗p21和抗β-肌动蛋白（作为负荷对照）抗体（上面板）进行western blot分析。还制备总RNA，逆转录并用Q-PCR分析cDNA中p21和GAPDH的表达。p21 cDNA的量除以GAPDH cDNA的数量，并计算使用对照siRNA转染的细胞相对于1的数量（下面板）。给出了5个独立实验的平均值和SD。（D） 与（C）中相同，不同的是，收集细胞并通过流式细胞仪分析细胞周期分布。对于通过对照siRNA转染的细胞，每种条件下G0/G1、S和G2/M细胞的比例相对于1进行量化。显示了3个独立实验的平均值和SD。（E） 使用指示的siRNA转染U2OS并用Nutlin-3处理。48小时后，制备总RNA，逆转录。然后通过Q-PCR分析cDNA的p21和GAPDH表达。p21 cDNA的量除以GAPDH cDNA的数量，并计算使用对照siRNA转染细胞和坚果素处理细胞的相对1。显示了两个独立实验的平均值。（F） 与（E）中相同，不同的是，如（D）所述，收集细胞并通过流式细胞术分析细胞周期分布。显示了两个独立实验的平均值。
图5
图5。ATM依赖性DDR是p400诱导衰老和凋亡所必需的。
使用指示的siRNA转染（A，B）IMR 90细胞（A）或HCT 116细胞（B）。转染后48小时，固定细胞并使用抗磷酸ATM抗体进行免疫荧光分析。使用ImageJ软件对磷酸ATM阳性细胞进行量化，并计算转染对照siRNA的细胞相对于1的比率。显示了三个独立实验的平均值和SD。（C） 将所示siRNA单独或联合转染IMR 90细胞。使用对照siRNA使转染中的siRNA总量保持不变。转染后7天，收集细胞并进行DAPI染色以分析SAHF的形成。（D） 与（C）中相同，只是针对仅转染对照siRNA的细胞，相对于1测量和计算衰老相关的β-半乳糖苷酶活性。给出了三个独立实验的平均值和SD。（E） 与（C）中相同，但提取mRNA并进行逆转录。然后通过Q-PCR分析cDNA的p16和GAPDH mRNA表达。p16 cDNA的量除以GAPDH cDNA的数量，并针对仅使用对照siRNA转染的细胞计算相对于1的数量。给出了三个独立实验的平均值和SD。（F） 将所示siRNA单独或联合转染HCT116细胞。使用对照siRNA使转染中的siRNA总量保持不变。转染后48 h，用流式细胞仪测定凋亡诱导率，并计算转染对照siRNA的细胞相对于1的凋亡细胞百分比。显示了三个独立实验的平均值和SD。
图6
图6。持续的DNA断裂足以诱发氧化应激。
（A） 如图所示，用OHTam处理U2OS HA-AsiSI-ER细胞4小时或48小时，或不处理。然后固定细胞，并使用抗HA（顶部面板）和抗γH2AX（底部面板）抗体进行DAPI染色和免疫荧光。（B） 与（A）中相同，但ROS水平是通过流式细胞仪测量的。显示了3个独立实验的平均值和SD（相对于未经OHTam处理的细胞的1进行标准化后）。
图7
图7。Hsp70和FANCA是p400的直接靶基因。
（A） 使用指示的siRNA转染U2OS细胞。转染后48 h，制备总细胞提取物，并使用抗FANCA、抗Hsp70和抗GAPDH（作为负荷对照）抗体进行western blot分析。（B） 使用p400抗体或不使用抗体对U2OS细胞进行ChIP实验。以下金额p21，磷蛋白P0,Hspa1a和FANCA用Q-PCR检测免疫沉淀物和输入物中的启动子。ChIP效率（输入DNA的%）是相对于1计算的p21蛋白p400抗体免疫沉淀的启动子。绘制了三个独立实验的平均值和SD。（C） 使用指示的siRNA转染U2OS细胞。转染后48小时，收集细胞，制备总RNA并逆转录。然后通过Q-PCR分析cDNA中Hsp70和GAPDH的表达。将Hsp70 cDNA的量除以GAPDH cDNA的量，并计算使用对照siRNA转染的细胞相对于1的量。显示了三个独立实验的平均值和SD。（D） 与（C）中相同，不同之处在于对cDNA的FANCA和GAPDH表达进行分析。
图8
图8。Hsp70的转录调控通过p400参与ROS控制。
（A） 使用指示的siRNA和Hsp70或FANCA表达载体（1.5µg）转染U2OS细胞。使用相应的空载体使转染中的DNA总量保持不变。48小时后，收集细胞，用流式细胞仪测量ROS水平，并计算通过对照siRNA和空载体转染的细胞相对于1的ROS水平。给出了三个独立实验的平均值和SD。两颗星（**）表示p值低于10−5（学生t-test）。B） 使用指示的siRNA转染U2OS细胞，并在转染后48 h收集细胞，用流式细胞仪测定ROS水平。显示了3个独立实验的平均值和SD（相对于1，对转染对照siRNA的细胞进行标准化后）。（C） 我们的p400:p400细胞增殖控制模型通过特定启动子的转录调节防止氧化应激。氧化应激反过来会导致持续的DNA损伤。这些持续的DNA损伤有助于额外的氧化应激增加（“正反馈回路”），并诱导DNA损伤反应途径的激活，从而导致细胞增殖的有力抑制（通过衰老、细胞周期阻滞或凋亡诱导，取决于细胞类型）。虚线代表p400在DNA修复中的假定作用（在其他物种中证明），这可能有助于DNA损伤的持续性。
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