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.2010年6月11日；38(5):675-88.
doi:10.1016/j.molcel.2010.03.019。

短RNA从受抑制的多梳靶基因转录而来，并与多梳抑制复合物-2相互作用

阿迪蒂·卡内尔 1, 凯霍·维里, 卡拉·C·阿拉乌约, 简·拉赛亚, 罗素·D·布曼, 沃伦·怀特, C菲利佩·佩雷拉, 艾米丽·布鲁克斯, 金伯利·沃克, 乔治·W·贝尔, 安娜·蓬博, 阿曼达·G·费舍尔, 理查德·A·杨, 理查德·詹纳
附属公司

短RNA从受抑制的多梳靶基因转录而来，并与多梳抑制复合物-2相互作用

阿迪蒂·卡内尔等。 分子电池. .

摘要

多梳蛋白通过抑制其他细胞类型特异性发育调节因子的表达来维持细胞特性。多梳抑制复合物-2（PRC2）催化组蛋白H3赖氨酸-27（H3K27me3）的三甲基化。尽管PRC2靶点受到抑制，但通常与转录起始标记H3K4me3相关，但其意义尚不清楚。在这里，我们确定了一类短RNA，约50-200个核苷酸的长度，从原始T细胞和胚胎干细胞中的多梳靶基因的5'端转录而来。短RNA转录与RNA聚合酶II和H3K4me3相关，在没有mRNA转录的情况下发生，并且与多梳活性无关。短RNA形成类似于Xist中PRC2结合位点的干环结构，通过SUZ12与PRC2相互作用，导致顺式基因抑制，并从细胞分化过程中激活的多梳靶基因中耗尽。我们认为短RNA在PRC2与其靶基因的关联中发挥作用。

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数字

图1
图1。人原代T细胞启动子相关短RNA的检测
答：。实验策略。从人CD4+T细胞中纯化短RNA，经多聚腺苷化、扩增并用Cy5标记，然后与Cy3标记的mRNA（实验1）或总长RNA（实验2）杂交到含有人类RefSeq基因启动子、5’外显子、第一内含子和3′外显子探针的定制微阵列中，以及snRNA和snoRNA的对照探针。B。背景：用于控制mRNA通道（x轴）和短RNA通道（y轴）中snRNA和snoRNA探针的阵列信号。C、。启动子区域（mRNA转录起始点上游约1 kb）、5′外显子（mRNA 5′端下游高达1 kb的部分）和产生短RNA的第一内含子。D。短RNA相对于平均基因TSS的分布，绘制为移动平均值，窗口为10 bp。E.公司。维恩图显示了与之前的两项研究相比，本研究中检测到的具有相关短RNA的基因之间的重叠（Kapranov等人，2007；Seila等人，2008）。
图2
图2。短RNA基因的转录状态
答：。根据我们的信使核糖核酸表达数据（1）或已发表的数据（2，（Su等人，2004）），具有启动子相关短RNA的基因产生可检测信使核糖核酸（黑条）或不产生可检测信使核糖核酸（灰条）的百分比。B。短RNA（灰色）和mRNA（白色）的阵列信号（中位数和四分位范围），这些基因产生可检测的mRNA或不产生可检测mRNA。C、。RNA pol II在未检测到mRNA的基因上的复合富集图谱。该图显示了平均折叠富集（来自RNA pol II ChIP与输入DNA的标准化信号），基因分为与短RNA相关的基因（绿色）和与短RNA无关的基因（蓝色）。平均基因转录的开始和方向由箭头指示。D。在没有可检测RNA的情况下，RNA pol II在表达短RNA的基因上的复合富集图谱。基因分为检测短RNA的那些基因，探针相对于mRNA TSS定位在-100到+100（红色）、-700到-500（绿色）或+500到+700（蓝色）。E.公司。短RNA位点的RNA pol II ChIP信号示例。图中显示了基因组区域内所有探针的未处理富集比率（RNA Pol II ChIP与整个基因组DNA）。染色体位置来自Build 35。基因的比例显示在下方，并根据染色体位置与图对齐。短RNA的位置由蓝色垂直箭头指示。F、。所有RefSeq基因中H3K4me3（绿色）和H3K79me2（红色）的复合富集图谱。该图显示了平均折叠富集（来自H3甲基化ChIP与总H3 ChIP的标准化信号）。G.公司。与F.一样，除了与短RNA相关但不与mRNA相关的一组基因。
图3
图3。短RNA位点与H3K27me3相关
答：。H3K27me3在未检测到mRNA的基因上的复合富集图谱，分为与短RNA相关的基因（绿色）和与短RNA无关的基因（蓝色）。该图显示了平均折叠富集（来自H3K37me3 ChIP的归一化信号相对于总H3 ChIP）。B。与H3K27me3相关的不同转录类别中的基因百分比。基因首先被分为产生可检测mRNA和不产生mRNA的基因，然后又分为产生可以检测到的短RNA和不生成短RNA的基因。C、。与mRNA无关的短RNA位点的CpG含量。数据绘制为观察到的CpG-含量除以预期CpG内容的直方图，并与不产生可检测到的短RNA或mRNA的控制基因进行比较。D。显示H3K27me3、H3K4me3和RNA pol II在与短RNA和H3K27me3相关的基因处富集的热图。每行代表一个基因，每列代表一个探针的数据，按其相对于TSS的位置排序。对于前三个面板，根据右侧的比例，用颜色表示折叠的丰富程度。最后一个面板覆盖RNA pol II（绿色）和H3K27me3（红色）以显示它们的相对位置。E.公司。与不产生可检测短RNA的基因（灰色条）相比，与mRNA和转录短RNA无关的基因集中GO类别的富集P值（黑色条）。F、。PBMC中多梳靶基因转录的短RNA的Northern印迹。单链RNA大小标记的位置如左图所示。短RNA转录的基因和相对位置显示在每个印迹的上方。
图4
图4。Ezh2和Ring1缺陷小鼠ES细胞中短RNA的转录
答：。小鼠ES细胞中多梳靶基因转录的短RNA的Northern印迹。B。Ezh2-1.3 ES细胞中Ezh2、组蛋白H3K27me3和总组蛋白H3在三苯氧胺诱导Ezh2-SET结构域基因缺失的5天治疗中的Western blotting。标记了特定的Ezh2带。C、。三苯氧胺处理Ezh2-1.3细胞期间Hes5、Msx1和Ybx2短RNA和5S rRNA的Northern印迹。D。ES-ERT细胞中的Northern印迹，在添加他莫昔芬后的1、2和3天内，他莫昔酚诱导了环1b，与相同时间点的未处理细胞相比。
图5
图5。PRC2在体外与短RNA相互作用
答：。左图：基于已知结合PRC2的Xist-RepA RNA重复区域的干环结构基序。右图：与H3K27me3相关的基因转录的短RNA百分比，该基因包含一个或多个（黑色条）或两个或更多（灰色条）RNA结构基序。在TSS周围显示相同分布但不产生可检测短RNA的基因组序列的相同数据显示为对照。B从抑制基因转录的短RNA中预测的能量结构示例。C、。EMSA用于32P-标记的RNA探针对应于Xist-RepA、突变的Xist-RepA、BSN短RNA、突变的BSN短RNA-以及带有T细胞核提取物（NE）的C20orf112、HEY1、MARK1和PAX3短RNA探针。D。与超过400或800倍的冷Xist-RepA或冷BSN短RNA的Xist-RepA结合竞争。E.公司。EMSA显示了表达为GST融合蛋白的PRC2亚单位与Xist-RepA和BSN短RNA探针的相互作用。GST单独用作阴性对照。F、。EMSA显示GST-SUZ12与短RNA探针的相互作用。G.公司。GST-SUZ12（0.25、1和5μg）对野生型和突变型Xist-RepA探针的亲和力。H。通过将GST融合蛋白与由ssRNA、ssDNA、dsDNA和RNA-DNA双链编码的BSN干环序列孵育来定义SUZ12的结合特异性。
图6
图6。PRC2与细胞内短RNA相互作用
答：。SUZ12 IP（灰色）和对照IP（白色）中不同RNA物种与输入RNA的折叠富集（平均值和SD，n=3），并通过定量反转录PCR测量归一化为肌动蛋白。上面指出了转录短RNA的基因和相对位置（E=外显子，I=内含子，P=启动子）。B。显示野生型HIV LTR-荧光素酶构建和修饰形式的示意图，其中编码TAR的R和U5被替换为Xist-RepA干环或C20orf112短RNA干环。标记用于RNA IP和ChIP实验的引物的位置。C、。与输入RNA相比，SUZ12 IP（灰色）和对照IP（白色）中含有不同RNA干环、肌动蛋白RNA和GAPDH RNA的荧光素酶RNA的折叠富集（平均值和SD，n=3）。D。用编码野生型或改良型HIV LTR下游萤火虫荧光素酶的质粒转染的Hela细胞中的荧光素素酶活性。萤火虫荧光素酶活性相对于共转染的Renilla荧光素酶绘制，并归一化为野生型LTR（7个实验的平均值和SD（用2个克隆进行），每个实验包括3个测量值。*比较结果显示p<0.05。E.公司。H3K27me3在不同荧光素酶结构体（标记于B)，标准化为在野生型LTR构造中测量的比率。比较中显示了3个内源性基因座（ACCN2、HAPLN2和HMX2）的数据。
图7
图7。神经元细胞激活的多梳靶基因中短RNA的丢失
答：。对PBMC（P）和分化的SH-SY5Y神经元细胞（N）RNA中CD4+T细胞中多梳靶向基因转录的短RNA进行Northern印迹。神经细胞中的活性基因被标记。B。定量PCR显示Hes5（灰色）和Pcdh8（白色）mRNA在向运动神经元（PMN）逐步分化过程中相对于肌动蛋白的表达（平均值和SD，n=3）。EB，类胚体（第2天）；EB+RA，EB用维甲酸治疗（第2天，8小时后）；NPC、神经元前体细胞（第3天）、PMN、前体运动神经元（第4天）；MN，运动神经元（第7天）。C、。ES细胞向PMN逐步分化4天期间Hes5和Pcdh8短RNA和5S rRNA的Northern印迹。D。我们的数据支持一种模型，即多梳靶基因5′端转录的短RNA与PRC2相互作用，稳定其与染色质的相互作用，并允许H3K27甲基化和顺式mRNA转录的抑制。
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