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.2010年7月15日；21(14):2529-41.
doi:10.1091/mbc.e10-02-0169。 Epub 2010年5月26日。

Arrestin-2与运输机械调节CXCR4内体分选所需的内体分选复合体相互作用

罗希特·马利克 1, 阿德里亚诺·马切斯
附属公司

Arrestin-2与运输机械调节CXCR4内体分选所需的内体分选复合体相互作用

罗希特·马利克等。 分子生物学细胞. .

摘要

趋化因子受体CXCR4是一种G蛋白偶联受体，通过泛素依赖机制（涉及运输（ESCRT）机械所需的内体分选复合体）靶向溶酶体降解。我们最近报道了arrestin-2也针对CXCR4进行溶酶体降解；然而，发生这种情况的分子机制仍不清楚。在这里，我们发现arrestin-2与ESCRT-0相互作用，ESCRT-0是一种识别泛素化货物并将其分类到降解途径中的蛋白质复合物。信号转导适配器分子（STAM）-1，但与STAM-2无关，直接与arrestin-2相互作用，并与CXCR4在早期内体抗原1阳性的早期内体上共定位。RNA干扰导致的STAM-1耗竭和arrestin-2/STAM-1相互作用的破坏加速了激动剂促进的CXCR4降解，表明STAM-1通过其与arrestin-2的相互作用负调控CXCR4内体分选。有趣的是，这种相互作用的破坏阻止了激动剂促进肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（HRS）的泛素化，而不是CXCR4和STAM-1泛素化。我们的数据表明，arrestin-2通过与STAM-1的相互作用，通过调节HRS的泛素化状态，调节CXCR4的分选。

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数字

图1。
图1。
Arrestin-2与ESCRT-0相互作用。（A） 用瞬时转染FLAG-STAM-1、FLAG-STAM-2或FLAG-HRS的HEK293细胞的裂解液培养等摩尔量（～134 nM）固定在谷胱甘肽-Sepharose树脂上的GST-arrestin-2和GST。使用抗FLAG-M2抗体通过免疫印迹检测结合蛋白。（B） 用纯化的arrestin-2（～212 nM）培养等摩尔量的GST-STAM-1、GST-STAM-2和固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖树脂上的GST。使用抗arrestin-2单克隆抗体检测到束缚arrestin-2。（A和B）用抗GST抗体剥离和重制印迹，以确定结合试验中使用的GST融合蛋白的水平。（C和D）从HeLa细胞中瞬时转染HA-arrestin-2、HA-arristin-3或空载体（pcDNA3）（C）或未转染（D）的裂解物与免疫沉淀转染（C）抗体或内源性抑制素（D）孵育，如材料和方法如图所示，通过SDS-PAGE和免疫印迹分析免疫沉淀物（IP）和裂解物。所示为三个（A–C）或四个（D）独立实验中其中一个的代表性斑点。
图2。
图2。
CXCR4调节arrestin-2/STAM-1相互作用。（A） 瞬时转染HA-arrestin-2的HeLa细胞如材料和方法，然后用30 nM CXCL12处理30和60分钟。细胞裂解物使用单克隆抗HA和同型控制抗体进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析免疫沉淀物和裂解物，检测内源性STAM-1和HA-arrestin-2。免疫印迹进行密度分析，条形图表示免疫沉淀物中HA-arrestin-2水平的平均STAM-1结合±SEM。与溶媒相比，激动剂治疗后STAM-1与arrestin-2的结合显著增加。数据通过单因素方差分析和Bonferroni事后检验进行分析（*p<0.05）。（B） STAM-1在CXCR4激活时优先泛素化。用100 nM CXCL12处理共转染HA-CXCR4、FLAG-STAM-1或FLAG-STAM-2和HA-u双肽的HEK293细胞30分钟。使用抗FLAG抗体免疫沉淀FLAG-STAM 1/2，然后进行SDS-PAGE和免疫印迹检测合并的HA-u单肽。为FLAG-STAM-1/2剥离并重新处理印迹，以评估负载。分析细胞裂解液中是否存在HA-CXCR4。所示为三个独立实验之一的代表性斑点。
图3。
图3。
Arrestin-2、STAM-1和CXCR4在早期内体上共定位。（A） 用30 nM CXCL12或载体处理表达HA-CXCR4-YFP的血清饥饿HEK293细胞30分钟。细胞固定、渗透并用抗STAM-1（红色）和抗EEA1（蓝色）双重染色。合并图像中的白色斑点表示所有三种蛋白质之间的共定位。CXCR4-YFP和STAM-1之间的共定位百分比如材料和方法条形图表示载体和SDF处理的细胞中CXCR4-YFP和STAM-1之间的共定位百分比±来自10个细胞的SEM。数据由Student’s分析t吨测试*p<0.0001。（B–D）用30 nM CXCL12或载体处理血清饥饿的HeLa细胞30分钟。细胞被固定、渗透，并用抗STAM-1（绿色）、抗EEA1（蓝色）和抗CXCR4（红色）进行三重染色（B）；抗CXCR4（红色）、抗arrestin-2/3（绿色）和抗EEA1（蓝色）三重染色（C）；并且用arrestin-2/3（红色）和EEA1（蓝色）对表达YFP-STAM-1的HeLa细胞进行双重染色（D）。合并图像中的白色斑点表示所有三种蛋白质之间的共定位。CXCR4和STAM-1（B；20%）、CXCR4与arrestin（C；30.7%）、YFP-STAM-1和arrestin-2（D；26%）之间的显色作用。按中所述进行量化材料和方法.Inset表示方框区域大小的4–8倍。显示了差分干涉对比度（DIC）图像。所示为三个独立实验的代表性显微照片。棒材，20μm。
图4。
图4。
STAM-1负调节CXCR4降解。用对照（GAPD）和STAM-1 siRNA转染稳定表达HA-CXCR4的HEK293细胞，如材料和方法用载体（含0.01%BSA的PBS）或30 nM CXCL12处理细胞3 h，然后通过免疫印迹和密度分析测定受体水平。条形图表示三个独立实验中CXCR4降解±SEM的平均量*p<0.05，未配对t吨测试。（B） 在转染有FLAG-CXCR4和siRNA的HEK293细胞中测量CXCR4循环，如A所述。表面受体用M1抗FLAG抗体标记，然后在含有0.1%BSA、20 mM HEPES、pH 7.4和1 mM Ca的DMEM中用30 nM CXCL12处理45分钟2+用Ca进行两次快速清洗，去除细胞表面残留的抗体2+/镁2+含0.04%EDTA的游离PBS。然后在含有1 mM Ca的DMEM中培养细胞2+和10μM AMD3100（CXCR4拮抗剂），并在37°C下培养30和60分钟。如材料和方法，并用作受体再循环的指标。条形图表示从三个独立实验中回收±SEM的内化受体百分比。（C） 条形图表示CXCL12处理的细胞与载体处理的细胞相比，细胞表面受体内在化的百分比。误差条代表三个独立实验的SEM。（D） 用GAPD和AMSH siRNA转染HeLa细胞，并按照A中的方法进行处理和分析。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。
图5。
图5。
STAM-1 GAT结构域对于抑制蛋白-2的结合是必要的和充分的。（A） STAM-1截断突变体以示意图形式表示。根据补充图S1所示的数据评估，右侧的GST-arrestin-2的结合或不结合分别用+和−符号表示。（B） 等摩尔量（～600 nM）的GST-arrestin-2和GST与瞬时转染FLAG-标记全长-STAM-1或STAM-1-ΔGAT的HEK293细胞的裂解物孵育。（C） 用瞬时转染FLAG-tagged arrestin-2的HEK293细胞的裂解液培养等摩尔量（～117 nM）的（GST-STAM-1，）GST-STAM-1-GAT和GST。在B和C中，通过免疫印迹检测结合蛋白，然后用胭脂红-S染色印迹来评估结合测定中使用的GST融合蛋白的量。所示为三个独立实验之一的代表性斑点。
图6。
图6。
GAT结构域的表达扰乱了arrestin-2/STAM-1的相互作用，并加速了CXCR4的降解。（A） 将来自用HA-rrestin-2和FLAG-STAM-1-GAT（S1-GAT）或空载体（pCMV）共转染的HeLa细胞的裂解物与抗HA和IgG对照抗体孵育。通过免疫印迹分析免疫沉淀物以检测结合内源性STAM-1，并分析裂解产物以评估各种结构的表达。所示为三个独立实验之一的代表性斑点。（B） 在表达FLAG-STAM-1-GAT或空载体（pCMV）的HEK293细胞中评估HA-CXCR4降解，如材料和方法.（C）受体降解百分比的图示。误差条代表三个独立实验的SEM。数据通过双向方差分析进行分析，然后进行Bonferroni的事后检验。（*p<0.0001）。所示为三个独立实验之一的代表性斑点。
图7。
图7。
在arrestin-2上映射STAM-1结合域。（A） 结合研究中使用的Arrestin-2截短突变体以示意图形式表示。GST-STAM-1和HA标记的arrestin-2截短突变体之间的结合在右侧显示为弱（+）、中间（++）和强（+++）。（B） 等摩尔量的GST-arrestin-2、GST-Arr2-（25-161）和GST与瞬时转染FLAG-tagged STAM-1和空载体（pCMV-10）的HEK293细胞的裂解物孵育。（C） 用瞬时转染FLAG-Arr-2-（25-161）的HEK293细胞的裂解物孵育等摩尔量的GST-STAM-1、GST-STAM-1-GAT和GST单独。在B和C中，使用抗FLAG抗体通过免疫印迹检测结合蛋白，并使用Ponceau-S对印迹进行染色，以评估结合试验中使用的GST标记蛋白的数量。所示为三个独立实验之一的代表性斑点。
图8。
图8。
Arr2-（25-161）的表达扰乱了STAM-1/arrestin-2的相互作用，并加速了CXCR4的退化。（A） 用T7-STAM-1、HA-arrestin-2和增加数量（0、1和2.5μg）的FLAG-Arr2（25-161）共同转染HeLa细胞制备裂解物。将裂解液分成等分，并与抗T7多克隆抗体或蛋白G琼脂糖单独孵育（对照）。免疫印迹法分析免疫沉淀物以检测结合的HA-arrestin-2，分析内源性HRS和裂解物以评估各种结构的表达。所示为三个独立实验之一的代表性斑点。（B） 在表达FLAG-Arr2-（25-161）或空载体（pCMV）的HEK293细胞中评估HA-CXCR4降解，如材料和方法（C）受体降解百分比的图形表示。误差条代表三个独立实验的SEM。数据通过双向方差分析进行分析，然后进行Bonferroni的事后检验。（*p<0.0001）。所示为三个独立实验之一的代表性斑点。
图9。
图9。
干扰STAM-1/arrestin-2相互作用抑制HRS泛素化，但不影响CXCR4和STAM-1泛素化。（A） 用FLAG-泛素和STAM-1-GAT结构域或pCMV转染稳定表达HA-CXCR4的HEK293细胞。（B） 用HA-ubiquitin、T7-STAM-1和STAM-1-GAT或pCMV转染HeLa细胞。（C） 除了T7-HRS也被转染外，细胞与A中一样被转染。对细胞进行血清饥饿处理，用30 nM CXCL12处理30–60分钟，然后进行免疫沉淀和免疫印迹检测结合的泛素，如材料和方法所示为六个（A）或三个（B和C）独立实验的代表性斑点。
图10。
图10。
提出了STAM-1/arrestin-2复合物在CXCR4内体分选中的作用机制。CXCR4在质膜上被E3泛素连接酶AIP4泛素化，之后被内化到早期内体上，尽管这一过程不需要泛素化。HRS识别泛素化的CXCR4，可能是通过涉及CXCR4上泛素部分（红色）和HRS的UIM的相互作用，也可能是通过与arrestin-2的相互作用。然后，Arrestin-2与STAM-1相互作用，STAM-1用于招募AIP4，最终导致HRS的泛素化。我们推测，这会触发HRS的构象变化，这是由泛素部分（蓝色）和内部UIM之间的相互作用引起的。CXCR4随后致力于与ESCRT-I-III的下游相互作用，而arrestin-2、STAM-1、AIP4和自动抑制HRS被回收，以便进行另一轮分拣。
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